в Содержание

Перечень тем

Занятие 11

Тема 8

ХРОМАТОГРАФИЯ.

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ.

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Студент должен знать сущность хроматографического процесса, блок-схемы хроматографов, параметры идентификации веществ и расчет их количества; уметь рассчитать эффективность хроматографической колонки по параметрам пика и по объему удерживания.

Хроматография - метод разделения, обнаружения и определения веществ, основанный на различии их поведения в системе из двух несмешивающихся фаз - подвижной и неподвижной.

Поскольку хроматографические процессы зависят от природы и концентрации веществ, хроматография является важным методом идентификации и определения веществ. Хроматографию используют для разделения сложных смесей веществ (нефть, лекарственные препараты, вещества растительного происхождения, кровь, пестициды и их метаболиты).

В хроматографическом процессе сочетаются термодинамический (установление равновесия между фазами) и кинетический (движение компонентов с разной скоростью) аспекты.

По способу хроматографирования различают колоночную и плоскостную хроматографию. В колоночном варианте разделение проводят в колонке, в плоскостном варианте - на бумаге или в тонком слое сорбента.

Сущность хроматографии. Хроматографический процесс заключается в перемещении подвижной фазы, содержащей компоненты разделяемой смеси, относительно неподвижной. Подвижной фазой может быть жидкость (раствор анализируемой смеси веществ) или газ (смесь газов или паров веществ), неподвижной фазой - твердое вещество или жидкость, адсорбированная на твердом веществе, которое называют носителем. При движении подвижной фазы вдоль неподвижной компоненты смеси сорбируются на неподвижной фазе. Каждый компонент сорбируется в соответствии со сродством к материалу неподвижной фазы. Неподвижную фазу называют сорбентом. Молекулы вещества с сорбента переходят в подвижную фазу и вместе с ней продвигаются дальше и затем наоборот. Чем сильнее вещество сорбируется на неподвижной фазе, тем медленнее его продвижение с подвижной фазой. Одни компоненты задерживаются в начале пути, другие продвигаются дальше. В результате на выходе из колонки сначала появляется наименее сорбируемое вещество, затем другие в порядке возрастания сорбируемости. Фиксируя аналитический сигнал на выходе получают хроматограмму, состоящую из ряда пиков, каждый из которых соответствует отдельным компонентам смеси. По оси абсцисс откладывают время, а по оси ординат - концентрацию веществ либо величину, связанную с ней (например, электропроводимость или оптическую плотность).

Хроматографические характеристики. Из всех видов хроматографии наибольшее значение имеет колоночная хроматография. Рассмотрим основные характеристики метода.

Коэффициент емкости. Эта характеристика показывает, на­сколько сильно вещество А удерживается сорбентом:

,

где k - коэффициент емкости;

nподв и nнеподв - число молей вещества А соответственно в подвижной и неподвижной фа­зах.

Коэффициент распределения. Равновесие, устанавливающееся при распределении вещества А между подвижной и неподвижной фазами, описывают коэффициентом распределения D:

,

где Снеподв и Сподв - концентрации вещества А в неподвижной и подвижной фазах.

Для каждого вида хроматографии коэффициент распределе­ния имеет свое название: в распределительной и ионообмен­ной - коэффициент распределения, в адсорбционной - коэффици­ент адсорбции, в гель-фильтрационной - коэффициент проница­емости.

Коэффициент разделения. Пусть разделяются два вещества А и В, степень разделения выражается коэффициентом разделения α, рассчитанным по формулам

где kА и kВ - коэффициенты емкости;

DA и DВ  - коэффициенты распределения веществ А и В.

Характеристики пиков. Каждый пик на хроматограмме харак­теризуют шириной, высотой, формой и временем удерживания (рис. 39, 40). Время удерживания tR отсчитывают от момента ввода смеси в колонку до появления на выходе из колонки максимума пика. С параметром tR связан параметр,называемый индексом удер­живания R:

где tm - время прохождения (мертвое время) растворителя или неудерживаемого вещества через ту же колонку. Для каждого вещества характерно свое значение R, поэтому время и индекс удерживания могут служить для идентификации веществ.

Для характеристики пика используют также параметр, называ­емый удерживаемым объемом V:

V = tRF,

где F - скорость, с которой продвигается определенный объем потока.

Обычно на практике используют исправленное время удер­живания (t'R) и исправленный объем удерживания (V'R). Эти парамет­ры учитывают время прохождения через колонку неудерживаемого компонента, в частности растворителя:

t'R = t R - tm,   V' R = VR - Vm.

Каждый пик характеризуется своей шириной w. Ширина равна основанию треугольника, образованного касательными к левой и правой ветвям пика (см. рис. 39).

Высота пика (h) определяется  от его основания до пересечения правой и левой ветвей пика.

Рис. 39. Характеристики хроматографического пика

-

Рис. 40. Определение разрешения пиков веществ А и В

Разрешение пиков. Полнота раз­деления и правильность определения зависят от того, насколько отделены пики друг от друга, желательно, что­бы они не перекрывались, в то же время расстояние между ними не должно быть очень большим, так как это неоправданно замедляет анализ. Для характеристики разделения пиков служит величина, называемая разреше­нием Rs:

или, если WA = WB   (см. рис. 40):

На рис. 41 приведены пики веществ А и В при разном разреше­нии.

Занятие 17

Рис. 41. Два пика с разным разрешением

При Rs=0,75 разделения прак­тически не произошло (см. рис. 41, а); при Rs=l,0 разделение частичное (см. рис. 41, б);  лишь при Rs=l,5 (рис. 41, в) можно считать, что оба ве­щества разделены полностью. Значе­ние Rs=1,5 является оптимальным только для симметричных пиков, если пики асимметричны (имеют фронт или хвост), оптимальное значение Rs будет больше.

Теория хроматографии. Для объяснения явлений, происходящих при хроматографировании, для расчета длины колонок, положения и формы пиков, для выбора оптимальных условий процессов существуют два подхода - теория теоретических тарелок и кинетическая теория.

Теоретическая тарелка - это абстрактная величина, ее можно представить в виде узкого слоя колонки, в котором достигается равновесие между подвижной и неподвижной фазами. Чем больше таких равновесий, тем эффективнее разделение. Число теоретичес­ких тарелок, таким образом, может служить мерой эффективности колонки. Обычно для эффективности колонки используют высоту, эквивалентную теоретической тарелке Н. Эта величина связана с длиной колонки L и числом теоретических тарелок N:

Занятие 11

Чем меньше Н, тем эффективнее колонка.

Кинетическая теория основана на скорости миграции вещества. Любая молекула вещества при движении вдоль колонки находится то в неподвижной, то в подвижной фазах, т.е. то движется по колонке, то останавливается. Таким образом, процесс хроматографирования является ступенчатым. От соотношения време­ни, проводимого молекулой в обеих фазах, зависит ее скорость продвижения по колонке.

Эффективность колонки в кинетической теории связывают с кинетическим параметром - временем удерживания tR:

.

Пример. Рассчитайте число теоретических тарелок и Н колонки длиной 40,2 см, если на хроматограмме максимум пика соединения А появился через 15 мин после введения образца и ширина пика 24,2 см.

Для этого находят

С позиций кинетичес­кой теории вполне объяс­нима форма пика в виде гауссовой кривой. Хроматограмма отражает статистическое поведение множества молекул, а не индивидуальной молеку­лы. Из-за случайного стечения обстоятельств одни молекулы могут продви­гаться с несколько боль­шими, другие – с меньши­ми скоростями. Поэтому наблюдаются отклонения от среднего значения ско­рости движения в ту и другую сторону, что и выражается кривой рас­пределения. Форма пика отражает поведение усредненной молекулы. Как и любую гауссову кривую, пик можно охарактеризовать стандартным отклоне­нием от среднего (σ = w/4).

На практике пики не всегда симмет­ричны (рис. 42). По ряду причин возможно размывание пика перед мак­симумом (размывание фронта) либо по­сле максимума (появление «хвоста»). Форма пика связана с характером изотермы сорбции, т.е. зависимостью концентрации вещества в подвижной фа­зе от его концентрации в неподвижной фазе при равновесии.

Рис. 42. Связь формы пика и характера изотермы сорбции:

а - изотерма линейна - пик симметричен; б - изотер­ма выпуклая - пик размыт со стороны фронта; в - изотерма вогнута - пик имеет «хвост»

Для получения симметричного пика изотерма должна быть прямой линией (см. рис. 42, а). Если изотерма выпуклая, наблюдается размывание перед фронтом (см. рис. 42, б), если вог­нутая - появляется «хвост» (рис. 42, в).

На продвижение частицы влияет ряд факторов, искажающих форму пика и снижающих эффективность колонки, а именно: структура неподвижной фазы (размеры гранул, их однородность, плотность и равномерность заполнения колонки); скорость уста­новления равновесия сорбция -десорбция (массообмен); диффузия молекул из зоны большей концентрации в зону меньшей концентрации. Влияние этих факторов на эффективность колонки учитывается уравнением Ван-Деемтера:

где v - скорость потока;

А - константа, связанная со структурой неподвижной фазы;

В - константа, связанная со скоростью потока и с коэффициентом диффузии в подвижной фазе;

С - константа, отражающая скорость массообмена.

Существует оптимальная скорость потока, при которой Н ми­нимальна (рис. 43).

Рис. 43. Графическое пред­ставление уравнения Ван-Де­емтера

Хроматографический анализ. При хроматографировании происходит разделение веществ. Далее разделенные вещества можно идентифицировать и количественно определить. При этом используют два приема:

1) собирают фракции после хроматографирования и анализируют их каким-либо методом количественного анализа;

2) вводят непрерывное автоматическое детектирование, используя подходящие детекторы для измерения аналитического сигнала от выходящих из колонки компонентов и самописцы для регистрации этого сигнала.

В результате получают хроматограмму, расшифровка которой и составляет основу хроматографического анализа. Положение пика на хроматограмме используют для качественного анализа, высоту или площадь пика - для количественного анализа.

Параметры этих двух показателей и являются критериями качественного и количественного анализа.

Качественный анализ. Важнейшие характеристики хроматогра­фии - время удерживания tR и связанный с ней удерживаемый объем - отражают природу веществ, их способность к сорбции на материале неподвижной фазы и, следовательно, при постоян­стве условий хроматографирования являются средством иден­тификации веществ. Для данной колонки с определенными скоростью потока и температурой время удерживания каж­дого соединения постоянно. Для идентификации вещества по хроматограмме обычно используют стандартные образцы или чистые вещества. Сравнивают время удерживания неизвестного компонента tx с временем удерживания tст известных веществ. Более надежна идентификация по относительному времени удер­живания:

При этом в колонку сначала вводят известное вещество (на­пример, пентан в газовой хроматографии) и измеряют его tR, а затем tx относительно tR этого стандарта.

Хроматограммы позволяют оценить степень чистоты мно­гих соединений, в частности растворителей: появление дополнительных пиков (помимо основного) указывает на загрязнение.

Количественный анализ. В основе этого анализа лежит зави­симость высоты пика h и его площади s от количества вещества. Для узких пиков предпочтительнее измерение h, для широких размытых - s. Площадь пика измеряют разными способами, например графически (площадь треугольника, см. рис. 39) или планиметром. В современных хроматографах имеется специальное устройство (электрический или электронный интегратор), измеряющее площадь пиков.

Для определения концентрации обычно используют метод градуировочного графика: строят графики зависимости h (s) от концентрации (С) для каждого компонента смеси.