Работа 8.1
Колоночная хроматография.
Качественный и количественный анализ веществ газовой хроматографией
Использование газовой хроматографии в анализе пестицидов объясняется сравнительной простотой метода и используемых приборов, высокой точностью, возможностью разделения и количественного анализа очень малых количеств смесей компонентов, быстротой выполнения анализа.
Современные приборы высшего класса снабжаются электронными интеграторами, автоматически определяющими площади пиков.
Из-за различий свойств анализируемых соединений чувствительность детекторов газовых хроматографов к разделяемым компонентам различна, вследствие этого при выполнении анализа детектор выдает неодинаковые по величине сигналы на равные по массе количества компонентов исследуемой смеси. Первостепенной задачей количественного хроматографического анализа является калибровка прибора, установление числовой взаимосвязи между сигналом детектора и количеством интересующего нас вещества.
Методы количественного хроматографического анализа: метод абсолютной калибровки и два метода калибровки прибора в косвенной форме - метод внутренней нормализации и метод внутреннего стандарта.
Метод абсолютной калибровки основан на построении графической зависимости одного из количественных параметров хроматографического пика (обычно высоты h или площади Si) от содержания вещества в пробе (Сi). В случаях, когда зависимость hi(Si) = f(Сi) имеет линейный характер, можно вычислить угловой коэффициент ki (нормировочный множитель) и определить содержание в пробе (m) искомого вещества по формуле
Метод калибровки требует точности и воспроизводимости в дозировании проб и строгого соблюдения постоянства условий хроматографирования при калибровке и при анализе. Величина ошибки 10-25 % и более.
Метод внутренней нормализации предусматривает отнесение величины сигнала детектора по каждому определяемому компоненту к величине суммарного сигнала, т.е. площади пика интересующего компонента к сумме площадей всех пиков.
Концентрацию компонентов в анализируемой смеси (С) находят по формуле
где Pi - нормируемые параметры хроматографических пиков;
ki - нормировочные (калибровочные) множители.
Калибровочные множители могут быть найдены экспериментально. Для этого хроматографируют искусственно составленные смеси интересующих компонентов с выбранным стандартным веществом и рассчитывают множитель по формуле
ki = (PcтCi) : (PiСcт),
где Pi и Рст - параметры пиков исследуемого и стандартного вещества;
Ci и Сст - их концентрация.
Калибровочный множитель стандартного вещества принимается равным единице. Калибровочные множители могут быть взяты из литературных источников, хотя они и несколько меняются в зависимости от конструктивных особенностей и режима работы приборов.
Преимущества метода внутренней нормализации по сравнению с методом абсолютной калибровки заключаются в устранении необходимости точной дозировки образца и соблюдения тождественности условий хроматографического анализа при повторных определениях. Точность метода повышается, по крайней мере, до 5%.
Метод внутреннего стандарта: к известному количеству анализируемого образца прибавляют определенное количество эталонного соединения - внутреннего стандарта и хроматографируют полученную смесь. Концентрацию вещества в смеси определяют по формуле
где Ci и Cст - концентрация i-го и стандартного веществ;
Рi и Рст - измеряемые параметры их хроматографических пиков,
ki - нормировочный множитель, который определяется относительно стандартного вещества, как это описано выше.
Аппаратура. Любой газовый хроматограф (рис. 44) состоит из блока регулировки подачи газа-носителя (1), инжектора - устройства для ввода образца (2) с термостатом 3, хроматографической колонки (4), также помещенной в термостат (5), детектора (6) и вторичного регистрирующего прибора (7).
Рис. 44. Блок-схема газового хроматографа (описание дано в тексте)
Ход анализа. Анализируемый образец в количестве 5-0,2 мкл вводят в инжектор, где он испаряется и смешивается с газом-носителем. С потоком газа-носителя он попадает в хроматографическую колонку, где и происходит его разделение на составляющие компоненты. Из колонки газ-носитель или его бинарные смеси уже с индивидуальными соединениями анализируемой смеси попадают в детектор, фиксирующий их концентрацию, которая затем воспроизводится графически вторичным прибором как функция по времени.
Определение концентрации проходящих через детектор соединений основывается на разности в теплопроводности газа-носителя и анализируемых веществ, на отличии в их способности к ионизации под действием мягкого излучения или водородного пламени и т.д.
При определении содержания действующего вещества в пестицидах характер детекторов не имеет принципиального значения, так как в данном случае мы имеем дело со сравнительно большими концентрациями, которые могут быть зарегистрированы практически любым видом детекторов.
Количественный анализ. Сигнал хроматографического детектора пропорционален концентрации вещества. Таким образом, основным параметром, характеризующим количество анализируемого компонента, является площадь пика (S), ограниченного контуром хроматографической кривой АВСДЕ и продолжением базовой линии KL (рис. 45).
Рис. 45. Определение параметров хроматографического пика
Однако точное определение площадей пиков возможно не всегда, например при неполном разделении компонентов. Поэтому при количественной расшифровке хроматограмм вместо площадей пиков могут быть использованы величины, пропорциональные площади.
Такими величинами могут быть, например, высоты пиков (h); произведения высот пиков на время удерживания (h tR); произведения полувысоты (1/2h1) треугольника (ΔKGL), образуемого касательными к ветвям пика в точках перегиба, на ширину пика (Wв) при основании (отрезок КL, отсекаемый на базовой линии этими касательными), или произведения полувысоты пика (1/2h) на ширину пика на половине высоты (W0,5). Использование только высоты пиков обосновано лишь при обсчете хроматограмм, содержащих симметричные пики.
Второй метод применим для случаев, когда ширина пика изменяется пропорционально времени удерживания, что, как правило, имеет место при анализе близких по химической природе веществ на высокоэффективных колонках.
Два последних метода дают более объективные результаты, однако второй из них более предпочтителен, так как менее трудоемок и исключает ошибки, возникающие при построении треугольников.
Современные газовые хроматографы, оснащенные системами пробоподготовки (например, ПФА), позволяют выполнять любые анализы биосред.
В СССР лучшими газовыми хроматографами были хроматографы серии ЛХМ-8МД (Московский завод «Хроматограф»).
В России газовые хроматографы производят несколько фирм (ЗАО СКВ «Хроматэк», г. Йошкар-Ола; ОАО «Цвет», г. Дзержинск Нижегородской области; НПФ АП «Люмекс», Санкт-Петербург).
Одним из лучших отечественных газовых хроматографов последнего поколения является хроматограф «Хроматэк-Кристалл 5000.1» (рис. 46).
Этот прибор, управляемый компьютером, дает возможность осуществлять любые анализы в промышленности (в том числе в химической, нефтехимической, пищевой и др.), в медицине, экологии, фармакологии и др.
Рис. 46. Хроматограф «Хроматэк-Кристалл 5000.1»
Хроматограф «Хроматэк-Кристалл 5000.1» оснащен совершенными устройствами ввода пробы и пробоподготовки: испаритель с автоматизированным регулированием деления потока, автоматические дозаторы ввода пробы, дозаторы равновесного пара, термодесорбер и устройство для пиролиза жидких и твердых образцов. Это позволяет анализировать любые вещества - газы, летучие и малолетучие соединения, а также твердые пробы (почва, отходы, полимеры и пр.).
Шесть детекторов (катарометр, ПИД, ПФД, ФИД, ТИД и ЭЗД), которые могут работать в различных сочетаниях, существенно повышают надежность идентификации контролируемых компонентов по сравнению с традиционными хроматографическими системами.
Устройство для парофазного анализа (ПФА) позволяет определять токсичные вещества в биологических жидкостях (кровь, плазма, моча, желчь и пр.) и биологических тканях и материалах. На рис. 47 представлен комплекс на базе хроматографа «Хроматэк-Кристалл 2000М».
Рис. 47. Комплекс на базе хроматографа «Хроматэк-Кристалл 2000М»
Этот метод имеет более широкие возможности для проведения двух анализов одновременно за один ввод пробы; имеет более широкий набор детекторов и испарителей; полный электронный контроль расхода или давления газов по 6 независимым каналам, программу обработки данных «Хроматэк-Аналитик».