Тема 8

Занятие 11

Работа 8.7

Определение аминокислот методом бумажной хроматографии

Приборы и реактивы: сушильный шкаф, пульверизатор, штатив, пробирки, хроматографическая бумага, нитки, раствор фенола, раствор нингидрина 0,1-0,2%-й, гидролизат белка, спирт, раствор аминокислот для хроматографического анализа. Готовят растворы, состоящие из трех различных аминокис­лот, по следующей прописи:

Смесь 1: в 10 мл дистиллированной воды растворяют 60 мг глютаминовой кислоты, 40 мг аланина и 50 мг лейцина.

Смесь 2: в 10 мл дистиллированной воды растворяют 60 мг глютаминовой кислоты, 40 мг гликокола и 40 мг аланина.

Смесь 3: в 10 мл дистиллированной воды растворяют 60 мг аспарагиновой кислоты, 40 мг серина и 40 мг лейцина.

Смесь 4: в 10 мл дистиллированной воды растворяют 60 мг аспарагиновой кислоты, 40 мг гликокола и 60 мг лейцина.

Метод распределительной хроматографии заключается в том, что каплю смеси амино­кислот, например гидролизата белка, наносят на полоску фильтровальной бумаги, конец которой опускают в подходя­щий органический растворитель. Растворитель поглощается полоской фильтровальной бумаги и увлекает за собой нане­сенные на бумагу аминокислоты. Скорость перемещения аминокислот на бумаге зависит от химического строения аминокислот и от их способности растворяться в подвижном и неподвижном растворителе. В качестве подвижного рас­творителя употребляют, например, водонасыщенный фенол (или амиловый спирт, н-бутиловый спирт и др.). Неподвижным растворителем является вода, пары которой, имеющие­ся в воздухе, насыщают фильтровальную бумагу. Внешне бу­мага остается сухой. Чем меньше растворимость аминокис­лот в воде и чем больше их растворимость в феноле, тем бы­стрее они движутся вслед за фронтом органического рас­творителя.

Положение аминокислот на бумаге можно обнаружить при помощи цветной реакции с нингидрином. Реакцию производят путем опрыскивания из пульверизатора высушен­ной полоски бумаги 0,1-0,2%-м спиртовым рас­твором нингидрина с после­дующим нагреванием ее в сушильном шкафу. Отдель­ные аминокислоты обнару­живаются в виде пятен, ок­рашенных в голубой, фиолетовый или оранжевый цвет (в зависимости от хи­мической структуры амино­кислоты). Скорость переме­щения отдельных аминокис­лот может быть выражена посредством коэффициента распределения (Rf).

Коэффициент распре­деления это отношение расстояния (мм) от места нанесения аминокислоты до середины ее пятна (а) к расстоянию от места нанесения аминокислоты до фронта раство­рителя (в) Rf = а/в (рис. 49).

Коэффициент распределения является характерной вели­чиной для каждой аминокислоты и постоянен при данных условиях опыта (растворитель, температура, сорт бумаги и др.).

Рис. 49. Хроматограмма амино­кислот

Ход работы. Вырезают полоску фильтровальной бума­ги длиной 12-15 см, шириной 1,5 см. Через верхний конец полоски протягивают нитку длиной 15-20 см и завязывают ее узелком. На нижнем конце полоски на расстоянии 1 см от края наносят карандашом кружок диаметром 3-4 мм.

В середину кружка при помощи капилляра наносят малень­кую каплю исследуемого раствора смеси аминокислот (например, смесь глютаминовой кислоты, аланина и лейцина) (рис. 50).

Рис. 50. Нанесение раствора аминокислот на хроматограмму

Место, где была нанесена капля раствора, подсушивают на воздухе.

На дно пробирки длиной 18-20 см, диаметром 2-2,5 см осторожно, не смачивая стенок, наливают из пипетки 15-20 капель фенола, насы­щенного водой. Приготовлен­ную бумажную полоску, при­держивая за нитку, опускают в пробирку с водонасыщенным фенолом так, чтобы она погрузилась в жидкость на 2-3 мм (рис. 51). Полоска должна висеть вертикально не касаясь стенок.

Рис. 51. Упрощенный прибор для распределительной хроматографии

Пробир­ку закрывают пробкой, ставят в штатив и помещают в тер­мостат при температуре 35-40°С на 1,2-2 ч. За это вре­мя фронт растворителя поднимается на 10-12 см.  По истечении указанного времени полоску вынимают из пробирки (за нитку) и подвешивают в вертикальном положении на 10-15 мин в сушильном шкафу, нагретом до 50-100 °С.

После испарения фенола (т.е. через 10-15 мин) бу­мажную полоску вынимают из сушильного шкафа. Ее подвешивают на штатив, опрыскивают из пульверизатора 0,1-0,2%-м раствором нингидрина и вновь помещают в су­шильный шкаф при температуре 100-110°С на 5-6 мин. В местах, где присутствуют амино­кислоты, появляются синие или фиолетовые пятна.

Бумажную полоску кладут на стеклянную пластинку (2010 см) и при помощи линейки измеряют расстояния (см. рис. 49):

1) от места нанесения капли раствора до сере­дины каждого пятна (а);

2) от места нанесения капли рас­твора до фронта растворителя (б).

Вычисляют коэффициент распределения для глютаминовой кислоты (первое пятно), аланина (второе пятно) и лейцина (третье пятно).

Можно по стандартам аминокислот выстроить калибровочный график. Вырезают и ножницами мелко измельчают бумагу с пятнами стандартов на хроматограмме. Так же поступают с образцами. Растворяют пятна в мерных колбах. Фотометрируют растворы отдельно с пятнами стандартов и образцов аминокислот. Рассчитывают количество аминокислот.