Работа 4.6
Определение нитратов в растениях и воде фотометрическим методом
Оборудование и реактивы: фотоэлектроколориметр, фарфоровые чашки, пипетки, стеклянные палочки, весы, фильтры, колбы на 200 мл, воронки, мерные колбы объемом 100 мл, водяная баня, дисульфофеноловая кислота (прил. 9.2), 30%-й раствор Н2О2, 10%–й раствор NaOH, активированный уголь, образцовый раствор нитрата (NO3– 0,01мг/мл или меньшей концентрации) (прил.10.2.), сульфат серебра (4,4 г Ag2SO4 растворяют в 1 л дистилята, 1 мл раствора эквивалентен 1 мг хлор-иона).
Принцип метода. Метод основан на образовании вследствии реакции нитратов с дисульфофеноловой кислотой нитрофенолов – соединений, дающих в нейтральной или слабощелочной среде характерное зеленовато-желтое окрашивание.
Сульфофеноловый раствор состоит из смеси кристаллического фенола и концентрированной серной кислоты.
Интенсивность окраски пропорциональна количеству нитратов в испытуемом образце. В основе определения нитратов лежит реакция:
3HNO3 + C6H3OH(HSO3)2 → C6H2OH(NO2)3 + 2H2SO4 +H2O,
дисульфофеноловая кислота пикриновая кислота
C6H2OH(NO2)3 +NaOH→ C6H2(NO2)3ONa + H2O
пикрат натрия
Соль пикриновой кислоты окрашивает раствор в желтый цвет. Молярный коэффициент погашения этого раствора ε=10 000 при λ 410 нм. Подчиняется закону Бера при концентрациях до 12 мг N/л.
Дисульфофеноловый метод позволяет определить только азот нитратов, даже при большом количестве нитритов. Мешают определению хлорид-ионы, аммиачные соли и кислотность раствора.
Нитраты полностью извлекаются из растений водой, поэтому для анализа можно использовать водную вытяжку. Из-за высокой подвижности этой формы азота в растениях содержание нитратов определяют в свежем растительном материале, но можно определять и в сухом.
Ход определения нитратов в растениях. Средние пробы свежего растительного материала измельчают на терке, ножницами или шинкуют ножом. На технохимических весах при помощи тарированной фарфоровой чашки или часового стекла отвешивают 5-10 г растительного вещества, помещают в стакан гомогенизатора, добавляют 25-50 см3 дистиллированной воды и гомогенизируют в течение 1 мин при 6 тыс. об/мин. При отсутствии гомогенизатора растительный материал растирают в ступке до однородной массы. Предварительное добавление в ступку с аналитической пробой зеленого растительного материала жидкого азота до полного промораживания вещества значительно ускоряет процесс измельчения.
Гомогенизированный растительный материал количественно переносят на фильтр и фильтруют в мерную колбу объемом 100 или 200 см3. Остатки растительного материала со стенок стакана гомогенизатора или из ступки смывают небольшими порциями дистиллированной воды и переносят на фильтр. Вещество на фильтре несколько раз промывают небольшими порциями дистиллированной воды. Затем такой водой доводят объем раствора в колбе до метки, закрывают пробкой и перемешивают.
После этого пипеткой берут 50 см3 фильтрата, помещают в фарфоровую чашку, добавляют 1-2 см3 Н2О2 и выпаривают содержимое фарфоровой чашки на кипящей водяной бане почти досуха.
Если нитраты определяют в сухом веществе, то готовят объем водной вытяжки, соответствующий навеске около 50 мг сухого вещества, при соотношении 1:125, помещают в фарфоровую чашку и выпаривают досуха. (При малом количестве нитратов навеску растительного материала увеличивают до 500 мг).
В чашку вливают 10-20 см3 концентрированной перекиси водорода (пергидроля), смачивают ею стенки фарфоровой чашки для растворения осадка желто-бурого цвета выпаренного фильтрата, чашку закрывают часовым или обычным стеклом, устанавливают на кипящую водяную баню и выдерживают до полного разрушения органических соединений перекисью водорода. Периодически добавляют пергидроль по 5-10 см3, смачивая им также стенки чашки после полного выпаривания предыдущей порции.
Завершают термическую и окислительную обработку фильтрата лишь после полного разрушения и окисления органических веществ. Устанавливают этот факт по абсолютно белому цвету сухого осадка солей на дне чашки и отсутствию желтоватых следов, оставляемых неразложившимися органическими соединениями выпариваемого фильтрата. Полностью не окисленные остатки органических соединений мешают определению в связи с обугливанием при взаимодействии их с дисульфофеноловой кислотой. Сухой и белый осадок солей в фарфоровой чашке охлаждают и смачивают из пипетки 1 мл дисульфофеноловой кислоты.
Стеклянной палочкой распределяют кислоту тонким слоем по всей внутренней поверхности чашки, одновременно растворяя осадок солей. Через 10 мин после растворения в чашку приливают 10 см3 дистиллированной воды и нейтрализуют ее содержимое, добавляя по каплям раствор 10 %-го раствора щелочи (NaOH). Реакцию среды проверяют по посинению красной лакмусовой бумажки и прибавляют еще одну каплю щелочи, так как ее избыток не мешает определению.
В присутствии нитратов в испытуемом растворе появляется желтое окрашивание. Затем окрашенные растворы через воронку переносят в мерные колбы вместимостью 100 см3. Многократно ополаскивают чашку и стеклянную палочку дистиллированной водой, доводят объем до метки, закрывают пробками и перемешивают. Оптическую плотность растворов измеряют на фотоэлектроколориметре с синим светофильтром (λ 400 нм) в кюветах шириной 2 см.
Концентрацию нитратов в исследуемых растворах на основании их оптической плотности находят по градуировочному графику.
Калибровочный график. В пронумерованные фарфоровые чашки берут 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 и 50 см3 образцового раствора нитрата с содержанием NО3 0,01 мг/см3. Следовательно, в соответствующие чашки внесено 0,01; 0,05; 0,10; 0,15; 0,20; 0,25; 0,30; 0,40; 0,50 мг нитрата. Чашки устанавливают на кипящую водяную баню и выпаривают содержимое досуха. Затем в сухие чашки с осадком нитрата калия приливают по 1 см3 дисульфофеноловой кислоты, смачивают всю внутреннюю поверхность чашки с осадком, через 10 мин приливают по 10 см3 дистиллированной воды и нейтрализуют раствор 10 %-й NaOH до появления устойчивого желтого окрашивания.
Окрашенные растворы для градуировочного графика переносят в пронумерованные мерные колбы вместимостью 100 см3, многократно смывая дистиллированной водой содержимое чашек в соответствующие мерные колбы. Затем объемы в колбах доводят дистиллированной водой до метки, закрывают пробками, перемешивают.
Измеряют оптическую плотность каждого раствора, начиная с наименьшей концентрации, на фотоэлектроколориметре при длине волны 400 нм (синий светофильтр, в кюветах шириной 2 см).
На миллиметровой бумаге вычерчивают калибровочную кривую, откладывая на оси ординат значения оптической плотности, а на оси абсцисс - соответствующие концентрации нитратов (мг/100 см3 окрашенного раствора).
Вычисление результатов анализа. Содержание нитратов (Х) в миллиграммах на 100 г сырого вещества рассчитывают по формуле
где: а - количество нитратов по градуировочному графику, мг;
Н - навеска анализируемого вещества, г;
V - объем фильтрата, см3;
V1 - объем фильтрата для выпаривания, см3.
Определение нитратов в воде. Берут 100 мл или менее фильтрата или прозрачной воды. Добавляют раствор Ag2SO4 в количестве, эквивалентном содержанию хлор-иона в пробе, и при необходимости сегнетовую соль. Выпаривают в фарфоровой чашке на водяной бане досуха. Если выпадает много хлорида серебра, перед выпариванием раствор отфильтровывают. После охлаждения сухого остатка в чашку добавляют 1 мл фенолдисульфокислоты и сразу растирают стеклянной палочкой до смешивания с сухим остатком. Добавляют 15-20 мл дистиллированной воды, через 15 мин - 5мл концентрированного аммиака до максимального развития окраски. Раствор переносят в мерную колбу на 100 мл, ополаскивают чашку небольшими порциями дистиллированной воды, сливают в колбу, доводят до метки. Оптическую плотность определяют на фотоэлектроколориметре с синим светофильтром (λ 480 нм) в кюветах с толщиной 2 см по отношению к дистиллированной воде с добавлением всех реактивов. Содержание азота нитратного определяют по графику. Для этого выпаривают 0,2; 0,5; 1,0; 2,0 мл стандартного раствора и получают концентрации от 0,02 до 0,20 мг азота нитратов. Содержание азота нитратного (мг/л) рассчитывают по формуле
Х = А∙1000/V,
где А - количество азота нитратов, найденное по калибровочному графику, мг;
V - объем пробы, взятой для анализа, мл.