|
4.3.
Технологические карты производства биопрепаратов Бактериальные и грибные препараты, предназначенные для защиты
растений от вредителей и болезней, нарабатывают обычно на искусственном
субстрате поверхностным, глубинным или глубинно-поверхностным
способами (см. главу 3).
Специфическим является производство вирусных и микроспоридиальных
энтомопатогенных препаратов. Это связано с тем, что микроспоридии
и вирусы насекомых -
облигатные паразиты, не способные размножаться на ПС. Производство таких
препаратов возможно либо на культуре клеток, либо на живых насекомых. В нашей
стране пока приемлем второй путь. Следовательно, основным блоком при
наработке энтомопатогенных вирусных препаратов является инсектарий. Несмотря на общую схему производства энтомопатогенных вирусных
препаратов, технология идентичных процессов при производстве конкретных
препаратов различна. Эти различия в основном связаны с биологическими
особенностями насекомых-хозяев и свойствами патогенов. Технология и
аппаратурное оформление самого длительного и трудоемкого процесса - выращивания личинок,
основаны на таких биологических особенностях разных видов насекомых, как
характер питания, продолжительность цикла развития, склонность к каннибализму
и образованию гнезд и др. В любом случае, при производстве биопрепаратов, предназначенных для
защиты от вредителей, обязательно присутствует стадия разведения насекомых
либо как тест-объекта для
оценки качества продукции, либо как сырьевой
культуры при производстве вирусных препаратов. В качестве примера приведем технологическую карту
производства биопрепарата триходермина,
нарабатываемого в условиях биолабораторий
поверхностным способом (ТУ 9291-003-011499291-93). 1. Характеристика конечного продукта производства Триходермин-БЛ - сухой порошок
темно-зеленого цвета, производится на основе гриба-антагониста Trichoderma viride
(lignorum), титр не менее 10 млрд.
спор/г. Массовая доля влаги - не более 8%. Гриб Trichoderma viridae относится к сем. Mucedinaceae,
пор.
Hyphomycetes, отд. Deuteromycota. Это
типичный почвенный обитатель, подавляет развитие других микроорганизмов, в
том числе фитопатогенов, путем прямого
паразитирования, конкуренции за субстрат, выделения ферментов, антибиотиков и
других биологически активных веществ. Триходерма
хорошо растет на искусственных питательных средах. Образует хорошо развитую
грибницу вначале белого, затем зеленого или желтого цвета. Конидиеносцы разветвленные, в массе составляют скопления
подушечковидной формы. Конидии округлые, мелкошиповатые,
3,5-4,5 мкм, темно-зеленого, иногда желто-зеленого цвета. Хламидоспоры
до 14 мкм. T. viridae
подавляет развитие около 60 видов фитопатогенов,
передающихся через почву и растительные остатки: активен
в отношении грибов из родов Fusarium,
Pythium, Phoma, Phytophtora, Alternaria, Botrytis, паразитирует на псевдосклероциях гриба Rhizoctonia solani, склероциях Sclerotinia sclerotiorum
и др. Препарат рекомендован для защиты различных сельскохозяйственных
растений от семенных инфекций, корневых гнилей и
других заболеваний. 2.
Технологическая схема производства Процесс производства триходермина
включает следующие стадии: 1. Поддержание маточной культуры гриба. 2. Получение посевного материала из маточной культуры. 3. Стерилизация
субстрата и его подготовка для засева культурой гриба. 4. Засев и выращивание биомассы на субстрате. 5. Высушивание, размол, фасовка. 6. Стандартизация и
контроль качества препарата. 3.
Сырье и материалы Для приготовления ПС в целях поддержания
маточной культуры T. viridae, а
также для стерилизации лабораторной посуды используются следующие вещества и
реактивы: агар микробиологический, сусло пивное неохмеленное, меласса, кукурузный экстракт, дрожжи
кормовые, формалин технический, натрий азотно-кислый, калий фосфорно-кислый
однозамещенный, калий хлористый, магний серно-кислый 7-водный, железо
сернокислое 9-водное, хлорамин-Б технический, соляная кислота, спирт этиловый. Для массовой наработки триходермина
используется один из имеющихся видов сырья - отходы ячменя от трихограммного
производства, зерноя ячменя, лузга подсолнечная или
отруби пшеничные. Из материалов необходимы марля медицинская, вата
гигроскопическая, индикаторная бумага, бумага фильтровальная, шпагат
хлопчатобумажный, бумага пергаментная, бумага оберточная марки А рулонная, мешки 4-слойные бумажные (крафт). 4.
Оборудование и приборы, производственные помещения При технологии поверхностного культивирования триходермина необходимо следующее основное оборудование и
приборы: 1. Автоклав. 2. Сушильный шкаф. 3. Термостаты. 4. Дистиллятор. 5. Медицинский шкаф для посуды. 6. Холодильник. 7. Вытяжной шкаф. 8. Размольная машина (шаровая мельница). 9. Микроскопы. 10. Весы технические и лабораторные. 11. Облучатель бактерицидный. 12. Стол лабораторный. 13. Стол письменный. 14. рН-метр. 15. Камеры Горяева. 16. Горелки газовые или спиртовки. 17. Скальпели и микробиологические иглы. 18. Шприцы, пипетки, чашки
Петри и другая лабораторная посуда. Для размещения перечисленного оборудования необходимо несколько
помещений. Примерный перечень: 1) рабочая комната - 14-16 м2 (для контроля качества
препарата и других целей); 2) автоклавная - 16-20 м2 для
стерилизации субстрата и лабораторной посуды; 3,4) бокс с предбоксником
(6+3м2) для
посева гриба; 5) термостатная - 24-30 м2 для
массового культивирования гриба; 6) комната для сушки биомассы; 7) моечная - 10 м2; 8) комната для размола биомассы - 9 м2; 9) склад для хранения - 10 м2. 5.
Описание технологического процесса 5.1. Поддержание молочный культуры
гриба Маточную культуру гриба хранят в холодильнике
при температуре 2-4°С. Не реже одного раза в месяц
чистую культуру пересевают при помощи микробиологической петли на одну
из агаровых сред -
сусло-агар, картофельный агар
или среду Чапека. При этом нельзя допускать вторичного роста культуры триходермы при хранении, так как при росте на обедненной
питательной среде споры менее жизнеспособны. Приготовление питательной среды - сусло-агар Необходимое количество пивного сусла разбавляют дистиллированной
водой до концентрации сахара 5-7%. К разбавленному суслу прибавляют 1,5-2%
агар-агара и, постоянно перемешивая, нагревают на медленном огне до его
расплавления. Готовую среду фильтруют и разливают в пробирки, которые
связывают по 5-50 шт., обертывают поверх пробок бумагой и стерилизуют в
автоклаве 30 мин при 1 атм. После стерилизации пробирки с питательной средой укладывают под
углом 20-30° до
полного застывания среды и получения «скоса». На охлажденную среду в чистом
боксе проводят посев чистой культуры гриба. Перед посевом бокс предварительно
стерилизуют бактерицидными лампами. На 3-4 день роста гриба из одной пробирки
берут мазок и под микроскопом проверяют чистоту культуры. Приготовление мазка На обезжиренное спиртом предметное стекло петлей наносят
небольшую каплю стерильной воды или физиологического раствора (0,85%-й
раствор поваренной соли). Стерилизуют петлю над пламенем горелки, вводят в
пробирку с культурой, охлаждают о стенку и затем захватывают небольшой
кусочек мицелия гриба, после чего петлю вынимают из пробирки не касаясь
стенок. Кусочек мицелия помещают на предметное стекло в каплю воды
(раствора), мазок накрывают покровным стеклом и просматривают под
микроскопом. 5.2. Получение посевного материала из маточной культуры Посевную культуру
готовят на тех же агаризованных средах. В отличие
от маточной культуры, которую поддерживают в пробирках, посевную культуру
необходимо готовить в больших емкостях (колбы - 0,5-1 л, банки - 0,5-3 л, молочные
бутылки -
0,5-1 л). Готовую среду разливают в подготовленные емкости, например, в
молочные бутылки, по 100-150 мл, закрывают ватно-марлевыми пробками. Поверх пробок
на каждую бутылку надевают бумажный колпачок и стерилизуют в автоклаве при
1,5 атм 30-40 мин. После стерилизации бутылки (колбы, банки) с расплавленной
питательной средой укладывают в наклонном положении (примерно под углом 20-30°) для получения скоса с
таким учетом, чтобы среда не смачивала пробку. После застывания среды емкости
ставят вертикально и дают стечь воде (конденсату). Подготовленную питательную среду засевают маточной культурой T. viridae микробиологической
петлей, шприцем или пипеткой из расчета по 0,5 мл суспензии, содержащей 0,5-1×106 КОЕ/мл, в каждую емкость и аккуратным покачиванием смачивают
всю поверхность среды. Выращивание посевной культуры проводят в термостатированном
помещении (или в термостате) при температуре 25-28°С в
течение 5-6 дней. За этот период культура заканчивает свой рост и развитие.
Максимальный срок хранения посевной культуры в холодильнике при температуре
2-4°С 5-6 месяцев. 5.3. Стерилизация субстрата и его подготовка для засева
культурой гриба Для массовой наработки триходермина
субстрат (отходы ячменя от трихограммного
производства, лузга подсолнечная или отруби пшеничные) увлажняют, при
использовании зерна ячменя его предварительно хорошо промывают и замачивают
на 8-10 ч. Субстраты, бедные азотистыми соединениями, обогащают азотом путем
смачивания их раствором аммонийной селитры. Затем субстратом заполняют банки
(либо другие емкости) на 2\3 их объема, закрывают ватно-марлевыми пробками и
бумажными колпачками. Стерилизацию субстрата проводят в автоклаве при 1,5 атм в течение 60 мин. После
стерилизации содержимое банок встряхивают для придания субстрату рыхлости.
При охлаждении субстрата до 30°С
проводят посев гриба. 5.4. Засев и выращивание биомассы на субстрате Подготовленный субстрат засевают посевной культурой, для
чего методом смыва готовят суспензию спор гриба плотностью 0,5-1×106 КОЕ/мл и вносят в субстрат из расчета 25 мл на 1 кг. После
посева гриба содержимое банок еще раз встряхивают для равномерного
распределения спор гриба в субстрате. Выращивание биомассы гриба до
образования обильного спороношения темно-зеленого цвета осуществляют
при температуре 25-28°С. Время массового
накопления гриба зависит от объема субстрата и может составлять от 7
до 30 дней. Работая со стеклянной посудой, можно визуально контролировать
развитие гриба. 5.5. Высушивание, фасовка, упаковка Субстрат со зрелой биомассой T. viridae
высыпают в пластиковые или эмалированные кюветы слоем не более 3 см и
проводят сушку при 30-35°С, хорошей вентиляции и
периодическом (ежесуточном) перемешивании. Влажность готового препарата не
должна превышать 8%. Готовый препарат затаривают в мешки из крафт-бумаги. Каждый
мешок маркируют с указанием номера партии, вида субстрата, даты изготовления
препарата, титра, срока и условий хранения. Также необходимо приложить
инструкцию по применению триходермина. 6. Стандартизация и контроль качества препарата Для определения количества жизнеспособных спор в готовом
препарате используется 2 метода: прямой подсчет в камере Горяева и метод высева
на твердую питательную среду в чашках Петри. Определение титра в камере Горяева От каждой партии препарата отбирают 3-5 проб из разных мест по
всей глубине и составляют общую пробу массой 70-100 г. Общую пробу тщательно
перемешивают, после чего отвешивают навеску 10 г с точностью 0,01 г и
переносят в колбу со 100 мл стерильной воды и стерильным крупнозернистым
песком. Колбу закрывают стерильной пробкой и взбалтывают ее содержимое в
течение 5 мин. Разведение препарата в приготовленной взвеси составляет 1:10.
Параллельно готовят 7-9 пробирок, в каждую из которых добавляют по 9 мл
дистиллированной воды, закрывают ватными пробками и стерилизуют. Затем
готовят серию последовательных разведений. Для этого из колбы автоматической
пипеткой со сменным наконечником берут 1 мл суспензии и переносят в первую
пробирку с 9 мл воды, получают разведение 1:100. Суспензию этого разведения
тщательно перемешивают с помощью пипетки с новым (чистым) наконечником, затем
берут 1 мл полученного разведения и переносят его во вторую пробирку
(разведение в 1000 раз). Таким же образом готовят и последующие разведения
(рис. 4.3). Для приготовления каждого разведения необходимо использовать
автоматическую пипетку с новыми (чистыми) сменными наконечниками .
Рисунок 4.2. Приготовление серии последовательных разведений для определения титра препарата Камеру Горяева с хорошо притертым стеклом (покровное стекло
перед заполнением камеры тщательно притирают до появления радужных колец)
заполняют суспензией соответствующего разведения (обычно 5-6). Количество
спор подсчитывают в 5 больших квадратах камеры (или в 20-100 малых
квадратах), определяют среднее количество клеток в одном малом квадрате и
рассчитывают титр по формуле:
где Х - титр исследуемой суспензии, клеток в 1 мл; N -
среднее количество клеток в одном малом квадрате. Для определения титра исходного препарата необходимо титр
исследуемой суспензии умножить на соответствующее разведение. Определение титра методом посева на питательную среду Готовят серию последовательных разведений как указано в
предыдущем методе. Из трех последних разведений, предварительно тщательно
перемешанных, производят посев в чашки Петри на агаризованную
среду Чапека или сусло-агар из расчета 1 мл
суспензии на чашку. Этот объем распределяют по поверхности среды стерильным
шпателем. Из одного разведения делают не менее 5 параллельных высевов. Для
параллельных высевов из одного разведения можно пользоваться одной стерильной
пипеткой и одним шпателем. Засеянные чашки помещают в
термостат с температурой 23-25°С. Первый учет
роста гриба проводят через 4-5 дней после посева, а затем через каждые
2-3 дня отмечают вновь появившиеся колонии антагониста. Титр препарата
вычисляют по формуле:
где Т - титр препарата, спор /
1г; А -
среднее число колоний, выросших при высеве из данного разведения (среднее
арифметическое из пяти чашек Петри); К - разведение, из которого
проведен высев. При использовании чашечного метода все операции необходимо
проводить в стерильном боксе. 7.
Техника безопасности и производственная санитария
при
массовой наработке триходермина При производстве триходермина следует
соблюдать общие правила техники безопасности для работы в микробиологических
лабораториях, правила работы с химическими веществами, стеклянной посудой, с
электроприборами и специальным оборудованием (бокс, автоклав) и др. Правила работы с культурами
микроорганизмов: ♦ при
приготовлении суспензий необходимо пользоваться автоматическими пипетками; ♦ при
взятии навески или проб работу необходимо проводить в вытяжном шкафу; ♦ не
допускать попадания живой культуры на кожу рук; ♦
после окончания работы вымыть руки теплой водой с мылом. При затаривании сухого триходермина в мешки необходимо соблюдать следующие меры
защиты работающих: ♦
наличие хорошей вентиляции в помещении или вытяжной системы; ♦
применение чехлов из плотной ткани, надеваемых на кюветы при пересыпании
препарата; ♦
использование респираторов марлевых и типа «Лепесток» для того, чтобы
предотвратить вдыхание пыли со спорами препарата во избежание раздражения
слизистых оболочек рта и носа или аллергических явлений. 8. Технико-экономический расчет (нормы расхода сырья и
материалов) Нормы расхода сырья и материалов на производство триходермина в условиях биолаборатории
(титр не менее 10 млрд. спор/г) отражены в табл. 4.4. Таблица 4.4 - Затраты на производство
1 кг триходермина
Спирт используется для стерилизации рук, стола, предметных
стекол, для горения спиртовки. Биопрепарат триходермин можно нарабатывать также глубинным и глубинно-поверхностным
способами, для чего требуется специальное оборудование, иной состав и
количество компонентов питательных сред. В связи с этим необходимо составить
новую технологическую схему производства препарата согласно измененному
технологическому процессу (технологической схемы производства). Производимые в биолабораториях
биологические средства защиты растений могут иметь постоянные или временные
ТУ. Таким образом, при производстве биологических средств защиты
растений неотъемлемым элементом является составление технологической карты.
Процесс наработки биологических средств состоит из нескольких этапов и
зависит от биологии объекта и его назначения.
|
