5.1. Культивирование клеток

Для защиты растений интерес представляют культуры клеток растений и насекомых. Они нужны для детального изучения биологии клетки вне организма и для клеточной инженерии.

В отличие от большинства животных клеток растительные обладают способностью регенерировать (восстанавливать) полноценные растения. При подборе искусственных питательных сред и определенных условий клетки изолированных тканей растений (культура клеток) могут сохраняться в живом состоянии, делиться и давать начало длительно растущей недифференцированной массе (каллусу).

Основным типом культивируемой растительной клетки является каллусная. Она представляет один из типов клеточной дифференцеровки, присущей высшему растению.

Для растения каллус является тканью, возникающей в исключительных обстоятельствах (при травмах) и функционирующей непродолжительное время. Эта ткань защищает место ранения, накапливает питательные вещества для анатомической регенерации.

Отдельные изолированные клетки, способные к размножению на питательных средах (ПС), можно получать разными путями:

♦ из тканей растений,

♦ из клеточных суспензий,

♦ из изолированных протопластов.

Для получения культивируемых каллусных клеток in vitro фрагменты тканей разных органов (экспланты) помещают на содержащую минеральные соли, источники углерода, витамины и гормоны ПС, в пробирки, колбы или чашки Петри. Процесс получения первичного каллуса и поддержания пересадочной культуры требует строго стерильных условий. Для этого с помощью растворов, содержащих активный хлор, стерилизуют экспланты, тщательно отмывая их затем от этих соединений стерильной водой. Стерилизуют в автоклаве 1 ч при 2 атм или в шкафу 1,5 ч при 160°С. Манипуляции с культурами проводят в боксах микробиологического типа.

Особенности дедифференцировки клеток экспланта и каллусогенеза зависят от характеристики составляющих его тканей. Клетки специализированных тканей, эксплантированные на питательную среду, должны дедифференцироваться, т.е. потерять структуры, характерные для их специфических функций в растении, и вернуться к состоянию делящейся клетки. Часто эксплант, используемый для получения каллуса, является фрагментом органа и включает ткани, клетки которых различно дифференцированы. Различное тканевое происхождение первичных каллусных клеток является одной из причин гетерогенности культуры каллусных клеток.

Субкультивирование заключается в том, что первичный каллус, возникший на эксплантах через 4-6 недель, переносится на свежую питательную среду. Размер транспланта при культивировании на агаризованной питательной среде колеблется от 60 до 100 мг массы ткани на 30-40 мл среды. Техника культивирования тканей растений позволяет получить длительную каллусную культуру из любых живых тканевых клеток растения. Различно дифференцированные клетки переходят in vitro к сложному процессу дедифференциации, теряют присущую им структурную организацию и специфические функции. Затем они образуют первичный каллус. В процессе субкультивирования формируется штамм, характеризующийся индивидуальными генетическими и физиологическими особенностями.

Каллусные клетки  культивируют двумя способами: поверхностным или суспензионным.

♦ Поверхностным способом культура каллусных клеток выращивается на полутвердой агаризованной среде (0,6-1% агар-агара). Основные компоненты среды - минеральные соли, витамины, углеводы, регуляторы роста. Иногда включают органические добавки: аминокислоты, дрожжевой экстракт. Каллусная ткань, выращиваемая поверхностным способом, представляет собой аморфную массу клеток, не имеющую определенной анатомической структуры. Цвет массы может быть белым, зеленым, желтоватым.

♦ Глубинное культивирование (суспензионные культуры). Это выращивание отдельных клеток или их агрегатов во взвешенном состоянии в жидкой питательной среде. Условия получения суспензионных клеточных культур более строги. Важные характеристики таких линий клеток - высокая степень дезагрегации (5-10 клеток в группе) и морфологическая выравненность.

Выращивание клеток в жидкой питательной среде имеет ряд преимуществ перед поверхностным способом. Здесь легче влиять на метаболизм и рост клеточных популяций экзогенными факторами. Кроме того, удобнее проводить биотехнологические операции. Клеточную суспензию получают, помещая каллусную ткань в колбу с жидкой питательной средой. Эта суспензия перемешивается в колбах на качалке или в специальных сосудах с помощью роллеров.

Для глубинного культивирования растительных клеток применяются способы выращивания, разработанные в микробиологии. Используются закрытые или открытые системы в периодическом или проточном режимах. В закрытой системе инокулюм помещается в определенный объем среды. До конца выращивания система закрыта по всем параметрам, кроме газов. Периодически старую среду удаляют, а свежую подают в том же объеме. В открытые проточные культуры периодически (или непрерывно) поступает свежая питательная среда, однако отбирается не только старая среда, но и часть урожая клеточной массы. Регуляция этого процесса может осуществляться по принципу хемостата. В хемостате скорость протока среды задается экспериментатором, а от нее зависит скорость роста клеточной массы.

Удобными объектами биологического конструирования являются изолированные протопласты

Такая «голая» клетка в дальнейшем способна восстановить новую клеточную оболочку, делиться и образовывать клеточные агрегаты, из которых можно получить растения-регенеранты.

Исходным материалом для выделения протопластов из растений служат ткани листьев и клеточные суспензии.

Способы выделения протопластов:

1. Механический, который ограничен трудностями выделения, длительностью и трудоемкостью (растирание).

2. Энзиматический (ферментативный). Для удаления клеточной стенки используются ферментные препараты трех типов: целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы.

Впервые протопласты были выделены в 1960 г. из клеток корешков томатов путем обработки их неочищенным ферментом целлюлазой. В первичной клеточной стенке на долю целлюлозы приходится 30%, гемицеллюлоз - 40 и 30% составляют пектины, белки и липиды.

При выделении протопластов из листьев их поверхностно стерилизуют и измельчают для улучшения проникновения ферментов. Количество протопластов и их стабильность во время выделения зависят от таких факторов, как способ стерилизации исходного материала, тип фермента, температура и т.д.

Для получения протопластов из суспензионных клеточных культур наилучшей является поздняя стадия логарифмической фазы роста. В этот период клеточные стенки легче всего поддаются энзиматическому разрушению, а протопласты наиболее жизнеспособны. После разрушения клеточных стенок суспензию протопластов необходимо очистить от остатков клеток и тканей фильтрованием. Смесь ферментов удаляют центрифугированием.

Культивирование протопластов. Существует несколько способов культивирования протопластов.

♦ Метод микрокапель применяют при культивировании небольшого числа протопластов. Объем капель, состоящих из суспензии протопластов в ИПС, не должен превышать 50 мкл. Для поддержания соответствующей влажности в середину пластиковой чашки Петри помешают несколько капель дистиллированной воды. Инкубация при определенной температуре ведет к размножению протопластов.

♦ Метод суспензии протопластов. Протопласты суспендируют в тонком слое (1 мм) жидкой питательной среды в колбах Эрленмейера (25 мл) или в чашках Петри, помещая их на качалки для перемешивания во время инкубации.

♦ Метод платирования. Определенный объем суспензии протопластов в жидкой питательной среде наливают в пластиковые чашки Петри, добавляют равный объем той же среды, содержащей 1% агар-агара. Чашки Петри заклеивают парафилмом и держат перевернутыми при 28°С. Преимущество в том, что протопласты здесь зафиксированы и физически удалены друг от друга. Это способствует их эффективному размножению.

Питательные среды для культивирования протопластов названными методами подобны таковым для клеточных культур.

Как же используют протопласты в биотехнологии?

Основной путь - это регенерация целого растения из протопластов. Регенерация клеточных стенок у протопластов происходит довольно легко. Быстрее регенерируют клеточную стенку протопласты, выделенные из клеточных культур, чем из дифференцированных тканей. Труднее добиться деления образующихся клеток и еще труднее получить целое растение. Тем не менее, варьируя уровень гормонов, можно стимулировать корнеобразование, формирование побега и эмбриогенез. Используется явление тотипотентности.

Первые удачные попытки культивирования растительных тканей были осуществлены в начале XX в. - выращены меристемы апексов растений томатов и кукурузы. К 1960 г. уже были разработаны крупномасштабные технологии выращивания суспензионных культур растительных клеток. Сегодня из культуры клеток регенерируют растения риса, пшеницы, картофеля и др.

Отсутствие клеточной оболочки позволяет выполнять генетические манипуляции, связанные с реконструкцией генома (например, внедрение чужеродной ДНК).

Протопласты являются уникальным инструментом в соматической гибридизации растений. Соматическая, или парасексуальная гибридизация заключается в том, что в качестве родительских используются не половые клетки (гаметы), а сомы (клетки тела) растений, из которых изолируют протопласты, и в отличие от полового скрещивания при соматической гибридизации в образовавшемся гибриде оба партнера имеют более или менее равный цитоплазматический статус. При образовании цитоплазмы от двух клеток, а ядра от одного получают цибриды.

Методы слияния протопластов. В принципе, изолированные протопласты за то время, пока они не образовали клеточной стенки, могут сливаться спонтанно. Но для направленности процесса применяют вещества, которые его облегчают и стимулируют. Эффективным индуцирующим агентом для слияния протопластов оказался ПЭГ (полиэтиленгликоль 1540-1600 м.м.). К смеси протопластов, нанесенной в виде отдельных капель на стеклянную поверхность, добавляют раствор ПЭГ из расчета 3 капли на 1 каплю суспензии клеток. Раствор ПЭГ готовят, добавляя 1г его к 2мл 0,1 М раствора глюкозы, содержащего 10,5 ммоль/л CaCl2 и 0,7 ммоль/л K2HPO4 ( pH = 5,5). Через 10-15 мин инкубации ПЭГ удаляют отмыванием либо средой культивирования, либо раствором с высоким рН и высоким содержанием кальция. В присутствии ПЭГ наблюдается сильная адгезия протопластов, а после удаления ПЭГ и добавления кальция - их слияние. Вместо ПЭГ иногда используют поливиниловый спирт (ПВС).

Метод электрического поля позволяет получить большое количество слившихся клеток. Суспензию из протопластов помещают между двумя электродами. Слияние начинается при подаче электрического импульса высокой частоты продолжительностью от наносекунды до микросекунды.

Слияние изолированных протопластов применяется для получения новых комбинаций генов.

В плане защиты растений от вредных организмов значимость соматической гибридизации обусловлена возможностью получения растений, устойчивых к болезням,

вредителям и гербицидам.

В данном случае объединяются клетки растений с высокой урожайностью, но не устойчивые к болезням, с клетками растений, устойчивых, например, к фитопатогену.

В результате слияния протопластов возникают два типа гибридных клеток:

♦ гомокарионы - состоящие из клеток одного родителя;

♦ гетерокарионы - состоящие из клеток обоих родителей.

Для получения новых комбинаций с устойчивостью к болезням нужны только гетерокарионы. Для отбора гетерокарионов существует несколько приемов: прижизненное окрашивание протопластов флуоресцентными красителями, центрифугирование в градиенте сахарозы и др. Гибридные растения, полученные слиянием соматических клеток in vitro, - это исходный материал для дальнейшей селекционной доработки (рис. 5.1).

Рисунок 5.1. Получение растительных протопластов,

их слияние и регенерация

Культуры клеток растений также используют для накопления вирусов растений или создания искусственного инфекционного фона (препарат вертокс против вилта хлопчатника).

В Японии путем слияния протопластов картофеля и дикого томата получен устойчивый к засухе и вилту сорт картофеля.

Р.И. Высоцкой и Е.Ф. Якубчик (ВИЗР) разработаны методы соматической гибридизации между сортами культурного картофеля и неклубнеобразующими видами картофеля с генами устойчивости к болезням.