3.1.1. Энтомопатогенные биопрепараты

Из биопрепаратов наиболее распространены энтомопатогенные. Энтомопатогены, являющиеся элементами природного биоценоза, служат основой биопрепаратов против вредителей сельскохозяйственных и лесных культур. В зависимости от природы энтомопатогенов различают бактериальные, грибные, вирусные и другие препараты.

Основой бактериальных энтомопатогенных препаратов является бактерия Bacillus thuringiensis Berl. (БТ).

Широкое распространение бактериальные препараты на основе БТ получили в связи с тем, что их производство наиболее технологично, а спектр действия достаточно широк.

Инсектицидная активность БТ связана главным образом с продуцированием эндо- и экзотоксинов. Детально изучен кристаллический δ-эндотоксин (рис. 3.2). Это термолабильный белок. Форма кристаллов варьирует в зависимости от подвида. Они могут быть бипирамидальные, округлые, квадратные. Кристаллы нерастворимы в воде, но растворимы в щелочных растворах.

Рисунок 3.2. Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki

а - колонии суточной культуры; б - клетки и белковые кристаллы эндотоксинов

Наряду с образованием термолабильного кристаллического эндотоксина некоторые подвиды БТ продуцируют термостабильный β-экзотоксин. В отличие от белковой природы эндотоксина экзотоксин имеет нуклеотидную природу. В большей или меньшей степени экзотоксин продуцируется подвидами thuringiensis, alesti, darmstadiensis и другими. Токсигенность БТ можно изменить, варьируя условия культивирования. Экзотоксин менее специфичен, чем эндотоксин, что объясняется разным механизмом их действия. Так, кристаллический δ-эндотоксин, попадая в кишечник насекомого, превращается в истинный токсин под действием щелочного рН и протеаз. Взаимодействие истинного токсина с мембраной эпителиальных клеток кишечника происходит по типу лектин-углеводного узнавания (как ключ и замок). Затем следует ряд биохимических реакций, которые подробно рассматриваются в курсе биологической защиты растений. Механизм действия β-экзотоксина иной.

Во-первых, он в 10-100 раз токсичнее при инъекции в полость тела гусениц, чем при попадании в кишечник.

Во-вторых, гусеницы младших возрастов могут быть менее восприимчивыми к токсину, чем старших. В высоких концентрациях экзотоксин действует на яйца насекомых. В отличие от эндотоксина он может проникать через покровы насекомых.

Известно несколько десятков подвидов БТ, пригодных для создания биопрепаратов.

Иногда выделенные в разных точках планеты подвиды называют по-разному. Впоследствии может оказаться, что это один подвид. Например, выделенный в Армении Bacillus thuringiensis subsp. caucasicus оказался идентичным выделенному в Германии subsp. darmstadiensis по биохимической и серологической характеристике. Хотя раньше был выделен первый подвид, в Институт Пастера для регистрации он был передан позднее. Подобная ситуация произошла с подвидами tenebrionis (Германия) и san-diego (США).

По активному действующему началу бактериальные препараты на основе БТ делят на 3 группы:

♦ Препараты, содержащие споры и кристаллы бактерий. Из отечественных препаратов в эту группу входят энтобактерин, дендробациллин,  лепидоцид.

♦ Препараты, содержащие дополнительно к спорам и кристаллам термостабильный экзотоксин, продуцируемый некоторыми подвидами БТ. В эту группу входит битоксибациллин.

♦ Препараты, содержащие только очищенные токсины, вырабатываемые бактерией. Примером такого препарата, состоящего только из β-экзотоксина, служит  турингин, а только из δ-эндотоксина - битиплекс.

По действию на насекомых подвиды БТ относят к разным патотипам (патовариантам):

♦ патотип А эффективен в основном против Lepidoptera;

♦ патотип В - против Diptera;

♦ патотип С - против Coleoptera.

Представителем препарата на основе B. thuringiensis subsp. kurstaki патотипа А является лепидоцид. К препаратам на основе патотипа В относится отечественный препарат бактицид = бактокулицид (B. thuringiensis subsp. israelensis), а к препаратам на основе патотипа С - колорадо (B. thuringiensis subsp. tenebrionis).

Схема производства бактериальных энтомопатогенных препаратов представлена на рис. 3.3.

Рисунок 3.3.  Технология производства бактериального препарата (Bacillus thuringiensis)

на искусственной среде (Франц, Криг 1984)

Во второй половине XX в. в нашей стране был организован массовый промышленный выпуск микробиологических препаратов, начиная с бактериальных инсектицидов энтобактерина и дендробациллина, которые производили на Бердском заводе биопрепаратов в Новосибирской области.

Бактериальные препараты производятся промышленностью путем наращивания биомассы

в ферментерах  на питательных средах.

Рост популяции бактерий происходит в виде S-образной кривой. В период начальной фазы (лаг-фазы) микроорганизмы приспосабливаются к питательной среде. Во второй фазе - фазе ускорения, занимающей наибольший отрезок времени, скорость роста популяции увеличивается от нуля до максимума. Третья - экспоненциальная фаза или фаза логарифмического роста характеризуется максимальной скоростью роста. Четвертая фаза - замедление роста и пятая - отрицательная фаза развития. Наконец, последняя - ускоренного отмирания. Процесс останавливают на четвертой фазе. Лизис клетки высвобождает споры и кристаллы БТ, которые являются основой препарата.

Методы борьбы с фаголизисом при производстве биопрепаратов. Серьезным осложнением при культивировании БТ является фаголизис микробной культуры (уничтожение ее бактерифагом). Острота вопроса возрастает с увеличением объема производства. Фаг (вирус) может проникнуть в культуральную жидкость с посевным материалом, аэрируемым воздухом, с питательной средой. Для исключения возможности проникновения фага со споровым посевным материалом предложен способ предварительного посева. Для этого в пустой ферментер вносят посевной материал, а затем подают стерильную горячую среду. Фаги гибнут при 70-80°С. Другим способом снижения фагового фона служит временный переход на выпуск продукции с использованием иных микроорганизмов, далеких от энтомопатогенов.

Создание малоотходной технологии производства бактериальных энтомопатогенных биопрепаратов. При многотоннажном производстве энтомопатогенных препаратов расходуется большое количество воды и образуется большой объем сточных вод. Основной промышленный сток производства энтомопатогенных бактериальных препаратов - фугат. Это культуральная жидкость после выделения из нее действующего начала препарата - спор и кристаллов эндотоксина. При производстве 1 т препарата образуется около 30 т фугата. Если сливать его в канализацию, то теряется значительное количество содержащихся в нем питательных веществ: азота, макро- и микроэлементов и т.д.

Сначала попытались использовать его вторично, добавляя в фугат недостающие количества питательных веществ. Однако это не дало положительных результатов из-за накопления в фугате некоторых ингибиторов роста БТ. Плодотворной стала другая идея - выращивать на фугате менее требовательные микроорганизмы, но чтобы их биомасса служила составной частью питательных сред для наработки БТ. Такими микроорганизмами явились дрожжи. Добавляя в фугат недостающие компоненты, получали питательную среду для выращивания дрожжей. После съема дрожжевой биомассы проводили автолиз при 45°С в течение 12 ч при периодическом перемешивании. Затем в автолизат добавляли 0,7% кукурузной муки и устанавливали необходимый рН. Такая среда оказалась подходящей для роста БТ.

На основании этих результатов разработана малоотходная технологическая схема - замкнутый цикл, который состоит из 8 стадий:

1) выращивание посевного материала;

2) приготовление первоначальных питательных сред;

3) культивирование энтомопатогена;

4) концентрирование культуральной жидкости (КЖ);

5) приготовление питательных сред из КЖ для выращивания дрожжей;

6) выращивание дрожжей;

7) гидролиз дрожжей;

8) приготовление питательной среды для энтомопатогенов.

Помимо бактериальных препаратов на основе БТ в нашей стране разработан микробиологический препарат бактороденцид на основе Salmonella enteritidis subsp. Issatschenko или subsp. Mereschkovski против грызунов.

Грибные энтомопатогенные препараты производятся на основе представителей отделов

Zygomycota и Deuteromycota.

Как известно, у грибов тело формируется из нитей (гифов), которые в массе образуют мицелий. Часто наблюдаются такие видоизменения мицелия, как хламидоспоры, склероции, аппрессории. Важная особенность энтомопатогенных грибов - проникновение в тело вредителя непосредственно через кожные покровы с помощью различных ферментов (например, хитиназы). Поэтому грибы заражают насекомых не только в фазе личинки, но и куколки, и имаго.

В отдел Zygomycota входят энтомофторовые грибы (порядок Entomophthorales), представители которых являются паразитами насекомых. Энтомофторовые грибы внутри насекомых образуют мицелий, который распадается на гифальные тела, которые разносятся гемолимфой по телу хозяина, замещая разрушенные ткани. На поверхности тела погибшего насекомого образуется бархатистый налет, состоящий из конидиеносцев с конидиями. Кроме конидий образуются покоящиеся споры, которые могут переживать неблагоприятные условия. Среди энтомофторовых грибов, являющихся основой биопрепаратов, известны Conidiobolus obscurus (=Entomophthora thaxteriana) Rem. et Kell., C. thromboides (=E. pyriformis) Drechler и др.

Отдел Deuteromycota, порядок Hyphomycetes. Самые распространенные возбудители болезней насекомых относятся к семейству монилиевых грибов (семейство Moniliaceae) в том числе грибы родов леканициллиум, боверия, пециломицес, метаризиум.

Род Lecanicillium (=Verticillium). Грибы образуют одноклеточные продолговатые бесцветные конидии, которые собраны в головки, соединенные слизью. Представитель - Lecanicillium muscarium (Petch) Zare et W. Gams (ранее рассматривали как Verticillium lecanii (Zimm) Viegas) - основа препарата вертициллин.

Род Paecilomyces. Грибы отличаются флажковидными клетками, которые заканчиваются длинными нитями, несущими конидии. Цепочки конидий могут слипаться в шары. Представители - P. farinosus (Holm) Brown et Smith, P. fumosoroseus (Wize) Brown et Smith (розовая мускардина).

Род Beauveria. Мицелий разветвленный, септированный, белый. Конидии шаровидные или яйцевидные. Наиболее известен возбудитель белой мускардины - B. bassiana (Bals.) Vuill. На основе этого гриба был создан первый советский грибной препарат боверин.

Род Metarhizium. Конидиеносцы образуют палисадный слой, несущий на вершине конидии. Конидии яйцевидные, темно-зеленые (зеленая мускардина). Возбудитель зеленого мускардиноза M. anisopliae (Metsch.) Sor. впервые выделен  И.И. Мечниковым из хлебного жука-кузьки более 100 лет назад и составил основу первого в мире грибного энтомопатогенного препарата, производимого в промышленных условиях.

К гифомицетам относятся также хищные грибы, образующие клейкие кольца для отлова нематод. Наибольший интерес представляет род Arthrobotrys с представителем A. oligospora Fres. Это основа препарата нематофагин.

Грибные препараты применяют против вредных фитофагов (насекомых, клещей и фитопатогенных нематод). Их действие тесно связано с наличием высокой влажности воздуха, в связи с чем грибные инсектициды широко применяются в теплицах.

Производство грибных препаратов осуществляется

в биолабораториях тепличных комбинатов,

а также коммерческими фирмами.

При получении грибных препаратов используют три способа:

♦ Поверхностное культивирование - выращивание биомассы в плоских емкостях (кюветах) на поверхности питательных сред.

♦ Глубинный способ - выращивание биомассы в жидкой питательной среде в емкостях с перемешиванием.

♦ Глубинно-поверхностный - комбинация двух способов.

Сначала культивирование проводится в глубинных условиях для накопления биомассы мицелия, затем биомасса помещается на поверхность питательной среды для массового спорообразования, поскольку для многих энтомопатогенных грибов спорообразование может идти только на поверхности субстрата. Бластоспоры, получаемые в глубинной культуре, не могут долго храниться и не приспособлены к размножению. Этот способ является наиболее целесообразным для производства биопрепаратов на основе грибов-дейтеромицетов.

Производство грибных препаратов включает следующие обязательные стадии:

1) приготовление из маточной культуры посевной;

2) стерилизация среды;

3) инокуляция посевной культурой;

4) выращивание гриба;

5) высушивание грибного материала;

6) стандартизация, фасовка и хранение.

Примеры производства основных грибных препаратов подробно рассмотрены в пособии по биопрепаратам.

Основой вирусных энтомопатогенных препаратов

(виринов) служат, как правило, бакуловирусы.

Семейство бакуловирусы - Baculoviridae. Это уникальные вирусы, которые можно увидеть в световом микроскопе за счет объемной белковой оболочки, включающей собственно вирусы - палочковидные вирионы.

По современной классификации (Rohrmann, 2013) в семейство бакуловирусов входят четыре рода: альфа-, бета-, гамма- и дельтабакуловирусы, которые включают вирусы ядерного полиэдроза (ВЯП) и гранулеза (ВГ).

Возбудители ядерных полиэдрозов представляют собой полиэдры (многогранники), внутри которых одиночно или пучками расположены вирионы. ДНК в вирионе имеет спиральную или суперспиральную структуру. Размеры полиэдра 1-10 мкм (рис. 3.4). У возбудителей гранулезов строение и размеры вирионов вирионов такие же, однако каждый вирион заключен в белковый матрикс овальной формы, который называется гранулой (рис. 3.5). В редких случаях встречается укладка двух вирионов в одну гранулу последовательно.

Альфабакуловирусы включают ВЯП, заражающие насекомых отряда Lepidoptera, бетабакуловирусы - это ВГ, заражающие насекомых отряда Lepidoptera, гаммабакуловирусы - ВЯП, заражающие насекомых отряда Hymenoptera, дельтабакуловирусы - ВЯП, заражающие насекомых отряда Diptera.

Рисунок 3.4. Полиэдры капустной совки х 10000	Рисунок 3.5. Гранулы озимой совки х 20000

Диагностика энтомопатогенных вирусов осуществляется методами световой и электронной микроскопии, а также серологическими и молекулярно-биологическими методами. Сюда можно отнести методы ИФА, пептидных карт белка, рестриктазного анализа ДНК или РНК, полимеразной цепной реакциии и молекулярной гибридизации. Эти методы будут рассмотрены в следующих главах.        

Вирусные энтомопатогенные препараты пока

производятся в малых количествах.

Это связано с тем, что вирусы размножаются только на живых насекомых (сырьевых культурах) или в культуре клеток,

а этот процесс достаточно трудоемок.

Высокая специфичность вирусов обусловливает их действие только на одного вредителя, что отражается в названии вирусных препаратов. Технология их получения представлена на рис. 3.6.

Рисунок 3.6. Схема получения вирусного препарата

По биотехнологии наработки к вирусным примыкают препараты на основе микроспоридий и энтомопатогенных нематод. Микроспоридии размножаются только на живых насекомых. Массовое производство энтомопатогенных нематод в комплексе с патогенными бактериями осуществляется в настоящее время на личинках насекомых и на ПС. В качестве насекомого-хозяина в большинстве стран используют гусениц пчелиной огневки (галерии). В ВИЗР разработан препарат немабакт на основе нематодно-бактериального комплекса Steinernema carpocapsae Weis. и бактерии Xenorhabdus (=Achromobacter) nematophilus Thomas et Poinar. Препаративная форма - пропитанная суспензией нематод поролоновая губка. Рекомендуется против яблонной плодожорки, щелкунов, капустных мух и др. Рекомендован также новый препарат на основе S. feltilae Filipjev. - энтонем F.

В США культивируют энтомопатогенную нематоду S. feltilae с ее бактериальным симбионтом X. nematophilus на жидкой ПС.

Против вредных насекомых и клещей успешно применяют препараты на основе очищенных микробных токсинов.

В последнее время широкое распространение получили препараты на основе авермектинов. Авермектины - продукты жизнедеятельности актиномицета Streptomyces, обладающие инсектицидной, акарицидной и нематицидной активностью. Основой химической структуры авермектинов является макроциклический лактон, связанный с двумя остатками сахаров.

Первый российский препарат на основе метаболитов почвенного сапротрофного актиномицета Streptomyces avermitilis Kim et Goodfellow - фитоверм. Создан также алейцид на основе метаболитного комплекса Streptomyces aurantiacus и актинин, действующим началом которого являются метаболиты Streptomyces sp. 0234 нонактиновой группы.

На основе токсинов энтомопатогенных грибов разработаны: вертициллин М - на основе токсичных для насекомых фосфолипидов, выделенных из биомассы гриба Verticillium lecanii, и микоафидин Т.

Для получения препаратов на основе микробных токсинов необходимо наработать биомассу отселектированных по целевому признаку штаммов. Культивирование проводят, как правило, глубинным способом в ферментерах. В процессе роста продуцент выделяет токсичные метаболиты, которые извлекают путем экстракции из культуральной жидкости.