Тема 4

Работа 4.10

Определение содержания хлорофилла в листьях фотометрическим методом

Оборудование и реактивы: фотоэлектроколориметр; весы; ступка с пестиком; колбы на 25, 50, 100 мл; воронки; бумажные фильтры; промывалка с дистиллированной водой; ацетон или 90%-й этиловый спирт; 4%-й раствор бихромата калия (4 г бихромата калия растворяют дистиллированной водой в мерной колбе на 100 мл); 1%-й раствор серно-кислой меди (1 г только синих кристаллов пятиводной серно-кислой меди растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе на 100 мл, фильтруют); концентрированный раствор аммиака (не менее 7%); раствор Гетри: в колбу на 100 мл вносят 50 мл 4%-го раствора бихромата калия, 28,5 мл 1%-го раствора серно-кислой меди, 10 мл аммиака, доводят объем до метки дистиллированной водой, перемешивают. Раствор Гетри по окраске эквивалентен раствору хлорофилла с концентрацией 85 мг/л.

Общие понятия. При точных определениях хлорофилл из объекта сначала выделяют хроматографическим методом или путем его омыления. При сравнительных исследованиях содержание хлорофилла можно определить в спиртовой или ацетоновой вытяжке, без предварительного разделения пигментов.

Калибровочный график. Нумеруют 7 мерных колб на 25 мл и 7 мерных колб на 50 мл. Наливают в первые номера по 2 мл раствора Гётри. В колбы под номером 2 наливают по 4 мл раствора Гётри, в следующие колбы - 6, 8, 12, 24 мл и в 7-ю - исходный раствор. Все растворы доводят дистиллированной водой до метки, встряхивают. Концентрация хлорофилла в колбах будет равна содержанию хлорофилла в вытяжках со спиртом и ацетоном 0,17; 0,34; 0,51; 0,68; 1,02; 2,04 мг/50 мл и на 25 мл.

На оси абсцисс равномерно через равные промежутки откладывают значения 12 концентраций от 0,2 до 2,4 мг/50 мл или на 25 мл. Затем откладывают значения оптической плотности стандартных растворов. На оси ординат откладывают 6 значений оптической плотности от 0,1 до 0,6. Снимают значения оптической плотности каждого стандартного раствора. Точки пересечения соединяют и получают калибровочный график. Фактически получают 2 калибровочных графика и пользуются ими при использовании в работе определенного объема вытяжки: либо 25, либо 50 мл. Оптическая плотность на этих графиках будет отличаться.

Ход определения. Взвесить 0,5-1,0 г растительного материала. Добавить чистого кварцевого песка и немного СаСО3 или мела. Прилить 4-5 мл ацетона (или этилового спирта, если проводить выделение со спиртом) и тщательно растереть. Профильтровать, ополаскивая ступку и пестик ацетоном, промыть материал ацетоном до обесцвечивания. Слить фильтрат в 25- или 50-миллилитровую мерную колбочку и довести объем до метки.

На красном светофильтре определить оптическую плотность раствора относительно чистого растворителя - ацетона, а если использовали спирт, то относительно спирта. Используют кюветы 10 мм, прикрывая их крышками. Надежные результаты получают при показаниях фотоколориметра от 0,1 до 0,4. Если оптическая плотность больше 0,5, то вытяжку следует разбавить, отмерив в чистую сухую посуду определенные объемы вытяжки и ацетона; если же показание фотоколориметра окажется ниже 0,08, то необходимо увеличить навеску. Определить концентрацию вытяжки по калибровочному графику на тот объем растворов, который использовали при получении вытяжки, т.е. либо 25, либо 50 мл.

Концентрацию хлорофилла выражают в процентах от массы сырых или сухих листьев. Расчет ведут по формуле

где В - количество хлорофилла в вытяжке по графику, мг;

А - масса сырых листьев, взятых для анализа, мг; 

100 - коэффициент для выражения количества хлорофилла в процентах.

Результаты определения записывают по фоpмe: