Работа 4.3
Микрометод, или ускоренный метод определения общего азота
Оборудование и реактивы: фотоэлектроколориметр или спектрофотометр; пробирки термостойкие диаметром 2 см и высотой 20 см с шарообразным расширением, как у колбы Кьельдаля, и точной меткой 40 мл или настоящие колбы Кьельдаля на 50 или 100 мл; штативы, электроплитки или песочные бани; градуированные пипетки; мерные колбы емкостью 1 л, 100 мл и 50 мл; H2SО4 концентрированная; реактив Несслера, 30%-я перекись водорода; 50%-й раствор сегнетовой соли; NН4Cl; лакмусовая бумага.
Общие понятия. В ряде случаев для массовых анализов необходимо использовать более быстрые, чем метод Кьельдаля, способы определения содержания азота в растительных образцах. Наиболее точными являются модификации, разработанные на основе метода Кьельдаля. Один из них - метод ускоренного определения азота с использованием реактива Несслера - был разработан 3.В. Чмелевой и С.Л. Тютеревым.
Принцип метода. Растительный материал озоляют с серной кислотой, для ускорения минерализации используют перекись водорода. Раствор нейтрализуют щелочью и окрашивают реактивом Несслера. По интенсивности окраски определяют содержание азота в исследуемом образце.
Ход определения. На аналитических весах отвешивают 100 мг тонкоразмолотой муки и переносят в термостойкую пробирку диаметром около 2 см, высотой 20 см и емкостью 40 мл (с точной меткой). Вместо градуированных термостойких пробирок можно использовать колбы Кьельдаля емкостью 50-100 мл.
Если вместо муки для анализа используют другой растительный материал, навеску бepyт с таким расчетом, чтобы в ней содержалось около 2 мг азота (примерно 200 мг).
В пробирки приливают по 3 мл концентрированной серной кислоты и по 0,5 мл 30%-й перекиси водорода и помещают в гнезда специального металлическою блока, установленного на электроплитке (газовой горелке). Озоление растительного материала проводят при температуре около 400 °С. Не следует допускать бурного кипения смеси. Для ускорения минерализации органических веществ через 1 ч после начала кипения в пробирки или колбы осторожно добавляют еще по 0,5 мл перекиси водорода. Нагревание продолжают до полного обесцвечивания содержимого пробирок.
После окончания озоления пробирки выдерживают еще 15-20 мин для окончания разложения перекиси водорода. Затем в охлажденные пробирки очень осторожно приливают воду примерно до половины объема.
Содержимое пробирок вновь охлаждают, доводят водой до метки (40 мл), закрывают пробками и тщательно перемешивают. Если вместо мерных термостойких пробирок для сжигания использовали колбы Кьельдаля, после охлаждения в них добавляют по 15-20 мл воды и содержимое количественно переносят в мерные колбы емкостью 50 мл. Колбы Кьельдаля тщательно обмывают несколько раз небольшими объемами воды и сливают их в мерную колбу. Затем содержимое колбы доводят водой до метки, закрывают пробками и перемешивают.
После этого готовят растворы для колориметрирования. В мерные колбы емкостью 50 мл наливают примерно по 20 мл воды. Затем из пробирок, в которых проводилось сжигание, или из колб, в которые был перенесен раствор после сжигания, берут точно по 2-5 мл вытяжки (в зависимости от предполагаемого содержания азота в исследуемых образцах) и переносят в мерные колбы. Содержание колб нейтрализуют 10%-м раствором NaOH (обычно на I мл вытяжки расходуют около 1 мл 10%-й щелочи). Конец нейтрализации определяют по посинению лакмусовой бумажки, на которую наносят из колбы каплю раствора стеклянной палочкой. Чтобы избежать появления опалесценции раствора, в колбы добавляют по 5 мл 50%-го раствора сегнетовой соли и приливают по 2 мл реактива Несслера. Необходимо строго соблюдать порядок добавления реактивов. Колбы доводят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают. Растворы должны быть совершенно прозрачными.
В результате реакции между аммиаком и реактивом Несслера раствор окрашивается при малом содержании азота в желтый цвет, при более высоком в оранжевый.
Оптическую плотность растворов определяют при 410 нм на синем светофильтре на спектрофотометре или на фотоэлектроколориметре.
Вычисление результатов. Содержание азота рассчитывают по калибровочной кривой, для которой используют образцовый раствор NН4Cl.
При приготовлении исходного рабочего раствора 0,382 г химически чистого перекристаллизованного NН4Cl растворяют в 1 л бидистиллированной воды и получают раствор с содержанием 0,1 мг азота в 1 мл. Из этого раствора путем десятикратного разведения готовят образцовый pacтвор с содержанием 0,01 мг азота в 1 мл.
Шкалу стандартных растворов готовят с концентрациями: 0,01; 0,02, 0,04; 0,06, 0,08; 0,10; 0,15; 0,20; 0,25 мг азота в колбах емкостью 50 мл. Для этого в мерные колбы берут 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25 мл образцового раствора, добавляют немного воды, затем по 0,5 мл 50%-го раствора сегнетовой соли и по 2 мл реактива Несслера. Содержимое колб доводят водой до метки.
Пример. Навеска муки 0,100 г. После сжигания в пробирке из общего объема 40 мл берут 2 мл, что соответствует 0,005 г муки. Если образец сжигали в колбе Кьельдаля и затем переносили раствор в колбу емкостью 50 мл, то аликвота в 2 мл соответствует 0,004 г муки. По калибровочному графику нашли, что оптическая плотность испытуемого раствора, равная 0,505, соответствует концентрации 0,139 мг азота в колбе емкостью 50 мл.
Таким образом, общее содержание азота в муке будет равно:
Умножив найденное количество азота на коэффициент 5,7 (для пшеницы), определяют содержание белка в воздушно-сухой муке:
2,78 · 5,7 = 15,85%.
Для перевода на абсолютно сухое вещество этот результат умножают на коэффициент влажности муки.