7.1. Основные методы генной инженерии

Достижения молекулярной биологии обеспечили проведение работ с рекомбинантными ДНК. Под рекомбинантными понимают ДНК, получаемые объединением двух и более фрагментов ДНК, выделенных из биологического материала разного происхождения. Здесь мы подходим к понятию генетического эксперимента. Генетический эксперимент предполагает смешение генетического материала двух различных клеток (рекомбинацию) и образование измененного потомства.

Генетический эксперимент стал основой технологий генной инженерии. Суть технологий генной инженерии состоит в воссоединении фрагментов ДНК в пробирке с последующим введением новых рекомбинантных структур в живую клетку. Перенос чужеродного генетического материала в организмы для придания им заданных свойств называют трансформацией.

Типовой эксперимент генной инженерии включает следующие этапы:

1) получение фрагментов ДНК;

2) конструирование рекомбинантных молекул ДНК из этих фрагментов и векторов;

3) введение сконструированных структур в клетку;

4) отбор клонов с нужной молекулой ДНК.

На этапе 1 берут ДНК, либо выделенную из различных организмов, либо полученную из и-РНК с помощью обратной транскриптазы. Чтобы выделить нужные фрагменты ДНК, используют ферменты - рестриктазы. Не всегда проникшая в бактериальную клетку чужеродная ДНК полезна. Для ограничения путей распространения чужой ДНК служат бактериальные рестриктазы. Они разрезают чужую ДНК как ножницами. В названии рестриктаз отражены названия бактерий, из которых они выделены. Например, рестриктаза EcoR1 получена из кишечной палочки E.coli.

На этапе 2 соединение фрагментов ДНК зависит от того, с какими концами получились фрагменты после разрезания рестриктазами - с «тупыми» или «липкими». Наиболее простой метод соединения фрагментов ДНК с «тупыми» концами - отжиг (реассоциация) с последующей обработкой сшивающим ферментом ДНК-лигазой. Если образовались симметричные разрезы от рестриктазы, то такие комплементарные друг другу участки имеют тенденцию «слипаться» за счет образования водородных связей между комплементарными последовательностями (фрагменты с «липкими» концами). Хотя ДНК-лигаза и здесь используется для восстановления целостности двойной спирали, ее эффективность значительно выше. Фрагменты с липкими концами образует, например, рестриктаза EcoR1.

Этапы 3 и 4. Введение в клетку рекомбинантных ДНК осуществляют, как правило, с помощью векторов. В качестве векторов используют молекулы ДНК, способные присоединять чужеродную ДНК и обеспечивать ее репликацию, экспрессию и/или трансформацию. Как правило, это плазмиды, бактериофаги, вирусы животных и др. Чаще всего применяются плазмиды. Это кольцевые молекулы ДНК (м.м.1-200 Мда), составляющие от 1 до 3% от клеточного генома и кодирующие важные генетические свойства. Например, они часто содержат гены устойчивости к антибиотикам. В природе, выполняя роль векторов, плазмиды могут поглощаться бактериями, которые их не содержали. Некоторые плазмиды размножаются в клетке до 100-200 копий. Это свойство обеспечивает клонирование нужного гена в биотехнологических операциях. Клоны с генами, несущими заданные признаки, отбирают для дальнейших операций.

Опыты с плазмидами, способными перенести в клетку чужеродную генетическую информацию (трансформировать клетку) положили начало генетической инженерии. Главной операцией в генной инженерии является введение в клетку и поддержание генетической информации, содержащейся в рекомбинантных молекулах ДНК.

Для получения трансгенных растений технология генной инженерии включает следующие этапы:

1) выбор гена и его клонирование;

2) подбор генотипа растения-реципиента;

3) введение гена и его экспрессия в геноме растения-реципиента;

4) регенерация трансформированных клеток и отбор трансгенных растений.

При выборе гена руководствуются необходимостью передачи растению определенного признака. Для успешной защиты растений от вредных организмов используют гены, определяющие устойчивость культурных растений к гербицидам, к вредителям и болезням. В качестве растения-реципиента требуется сорт, отличающийся высокой урожайностью, устойчивостью к абиотическим факторам, но имеющий лишь одно отрицательное свойство, например, высокую восприимчивость к болезням. При введении гена в растение важно обеспечить его экспрессию в геноме растения-реципиента и стабильное наследование признака в поколениях. Наконец, регенерация взрослых растений из трансформированных клеток зависит от тотипотентности клеток. Это свойство лучше проявляется у клеток двудольных растений, поэтому чаще трудности с регенерацией наблюдаются у однодольных растений.

Основная проблема при получении трансгенных растений - способ введения генов в хромосомы растений. Существует несколько методов.

Использование природной системы трансформации растений. В природе агробактерии Agrobacterium tumefaciens, внедряясь в растения, способны вызывать образование корончатых галлов (опухолей). В качестве векторов служат плазмиды, которые названы Ti-плазмидами от английского выражения tumor inducing (вызывающие опухоли). Ti-плазмиды содержат гены двух типов: 1) необходимые для метаболизма самой бактерии и 2) необходимые для трансформации растительной клетки. Часть Ti-плазмиды переносится в ядро растительной клетки и может встраиваться в растительный геном. Этот фрагмент плазмиды назван Т-ДНК (transfer - перенос). Наличие этого фрагмента необходимо, но недостаточно. За вырезание Т-ДНК и перенос ее в геном растения отвечает vir-область плазмиды со структурными и регуляторными генами. Поэтому для трансформации растений необходимо выполнение трех условий:

♦ активация генов на хромосоме агробактерий, кодирующих синтез полисахаридов для прикрепления к растительной клетке;

♦ активация vir-области Тi-плазмиды;

♦ наличие Т-ДНК.

Трансформация растительных клеток путем совместного культивирования с агробактериями наиболее распространена для двудольных растений. Для этого векторную конструкцию, содержащую чужеродный для растения ген, встраивают в Т-ДНК агробактерий. Полученными агробактериями трансформируют растительные экспланты. В качестве эксплантов обычно используют стерильные листовые диски. Достаточно 24-48 ч совместного культивирования растительных клеток с такой агробактерией, чтобы фрагмент Т-ДНК с чужеродным геном встроился в растительный геном. Далее переносят экспланты на среду с антибиотиком, что приводит к гибели агробактерий. Подбирают компоненты среды для выживания только трансформированных (трансгенных) растений. Через 2-5 недель на трансформированном экспланте развиваются побеги.

Для трансформации однодольных растений эффективен

метод биобаллистической трансформации.

Это прямой перенос ДНК в растение. В качестве исходного материала берут каллусную ткань или суспензионные растительные культуры. Суть метода состоит в том, что на мельчайшие частицы вольфрама, платины или золота (диаметром 0,6-1,2 мкм) напыляется ДНК вектора, содержащего необходимую генную конструкцию. Частички, несущие ДНК, помещают внутрь биобаллистической пушки (специального вакуумного устройства). Каллус или суспензия клеток помещается под пушкой на расстоянии 10-15 см в чашках Петри. Сначала в пушке создается вакуум (уменьшение давления до 0,1 атм). А в момент резкого увеличения давления частички с ДНК с огромной скоростью выбрасываются и, разрывая клеточные стенки, входят в цитоплазму и ядро клеток. Трансформированные клетки переносят на среду для дальнейшего культивирования и регенерации. (рис. 7.1). В некоторых случаях метод можно применять и для двудольных растений.

Рисунок 7.1. Схема получения трансгенных растений

Для прямого переноса генов в однодольные и двудольные растения  используется также введение ДНК в протопласты. Применяют электропорацию, микроинъекцию ДНК и упаковку ДНК в липосомы.

Электропорация заключается в том, что на растительные протопласты в среде, содержащей ДНК, кратковременно действуют высоковольтным импульсом (в течение долей секунды). Через образовавшиеся в мембране протопластов поры проникают молекулы ДНК. Протопласты затем высевают на соответствующую среду для регенерации.

Помимо электропорации можно применять микроинъекцию ДНК в изолированные протопласты. Для этого их прикрепляют к стеклу и вводят микроиглой ДНК. Эффективность метода не более 10-15%.

Кроме того, для введения в протопласты экзогенного генетического материала используют упаковку ДНК в липосомы. Липосомы - сферические образования, оболочки которых состоят из фосфолипидов. Они защищают вводимый материал от действия нуклеаз. Но эффективность метода составляет всего 1%.

В последнее время перспективным считается генетическая трансформация хлоропластов растений (например, биобаллистическим методом). Каждый хлоропласт содержит автономную ДНК. Очень важным преимуществом трансформации хлоропластов над ядерной (введением ДНК в ядро) является материнское наследование пластидных генов. Это свойство обеспечивает как предотвращение передачи нового признака в экосистему, так и возможность опыления близких видов. Аналогичные функции у животных выполняет митохондриальная ДНК.