5.2. Получения безвирусных клеток растений

Из клеточных технологий для защиты растений значимо микроклональное размножение растений. Оно осуществляется для ускоренного размножения и оздоровления цветочно-декоративных и сельскохозяйственных растений. Универсальной и многоцелевой средой для растительных клеток является среда Мурасиге и Скуга с разными модификациями.

Этапы микроклонального размножения растений:

♦ введение в культуру in vitro;

♦ размножение клонов;

♦ укоренение вновь образованных in vitro побегов;

♦ акклиматизация клонов.

Большое распространение получили биотехнологические методы производства безвирусного семенного материала.

Начало практического применения метода апикальной меристемы для освобождения вегетативно размноженных культур от вирусных болезней положено работами Мореля и Мартина в 1955 г. Им удалось получить растения картофеля, освобожденные от вирусов Х, У, А из зоны верхушечной меристемы размером 100-200 мкм.

Применяемая сейчас биотехнология оздоровления картофеля предусматривает следующие этапы:

♦ подготовка клубней для вычленения верхушечных меристем: отбор визуально здоровых растений; проращивание в темноте при температуре 35-37°С и влажности 75% в течение 1-2 месяцев;

♦ вычленение меристем размером 100-200 мкм в микробиологическом боксе под бинокулярным микроскопом с масштабной сеткой при 30-50-кратном увеличении и посадка их в чашки Петри на питательную среду с минеральной основой;

♦ выращивание меристем в чашках Петри в помещении с регулярными условиями температуры 23°С, влажности 70% и освещенности (5-10 тыс. лк при 16-часовой экспозиции);

♦ пересадка 3-5-миллиметровых проростков в пробирки на свежую питательную среду с добавлением ауксина для укоренения и ускорения роста;

♦ диагностика полученных растений на вирусы методом иммуноферментного анализа (ИФА) и выбраковка зараженных образцов;

♦ расчеренковка отобранных растений по количеству междоузлий  и посадка черенков на питательную среду в пробирки;

♦ повторная проверка линий на зараженность вирусами методом ИФА в процессе черенкования;

♦ пересадка растений из пробирок в теплицы для получения клубней;

♦ проверка тепличных растений методом ИФА;

♦ применение методов ускоренного размножения с целью получения больших партий материала, необходимого для включения в семеноводческую работу (укоренение верхушек и пазушных побегов, черенкование растений и посадка черенков с ограниченной площадью питания 6×6 см, черенкование ростков и т.д.);

♦ 1-2-годичное испытание и размножение тепличных меристемных клонов в полевых условиях на изолированном участке;

♦ сохранение коллекции оздоровленных сортов.

Применение данной технологии позволяет в течение года получить несколько тысяч меристемных клонов для включения их в первичное семеноводство (рис 5.2).

Рисунок 5.2. Этапы получения безвирусного картофеля

Модификация данной технологии включает использование так называемого «картофельного дерева» (КД) - гидропонной установки для производства безвирусных мини-клубней картофеля. Установка состоит из вегетативных лотков, образующих посадочное поле, емкостей для питательного раствора, насоса и источников света. Безвирусные пробирочные растения картофеля фиксируются в посадочных крышках, установленных на рамке, под которой расположен наклонный лоток. Водообеспечение и минеральное питание растений осуществляется путем периодического орошения корневой системы питательным раствором.

В работе по улучшению признаков сельскохозяйственных растений методы in vitro приобретают все более важное значение.

Возникает необходимость сохранять полученный нетрадиционными методами материал в течение определенного промежутка времени в ходе экспериментов.

Для поддержания культуры тканей растений обычно требуются регулярные пересадки на свежую питательную среду через каждую неделю, две недели или месяц. Это оказывается довольно трудоемким процессом, особенно при наличии нескольких культур. Поэтому как в практическом, так и в научном отношении необходимы альтернативные методы хранения, требующие меньше времени и финансовых затрат.

Существует два основных подхода к хранению растительных культур: путем замедленного роста и криосохранения.

♦ Медленный рост. Наиболее очевидный путь замедления роста состоит в снижении температуры культивирования. Другой способ, часто в сочетании с первым, заключается в использовании гормональных или осмотических ингибиторов. Такие культуры не требуют специальной обработки, необходимой для увеличения времени между пересадками и обеспечения соответствующих условий хранения. Однако для большинства культур необходимы факторы, ограничивающие рост.

♦ Криосохранение. Глубокое замораживание и хранение при температуре ниже -140°С (при температуре жидкого азота -196°С) является радикальным средством преодоления генетической нестабильности длительно культивируемых in vitro клеточных штаммов. При этом необходимо соблюдать особые условия при подготовке материала к замораживанию, в процессе замораживания и оттаивания, а также в ходе возобновления роста.

Основные методы криосохранения всех видов растительных тканей, культивируемых in vitro, в основном сходны.

Схема криосохранения включает следующие этапы:

– асептическое изолирование и культивирование растительных тканей;

– адаптация к низким температурам (если необходимо);

– предварительное культивирование материала на соответствующей ПС, дополненной криопротекторами;

– добавление криопротекторов  к образцам в подготовительной стадии замораживания;

– контрольное охлаждение и замораживание проб;

– сохранение в жидком азоте;

– быстрое размораживание растительных тканей;

– отмыв криопротекторов;

– тестирование образцов на жизнеспособность;

– повторное культивирование восстановленных тканей.

В зависимости от опытного материала необходимо модифицировать отдельные этапы.

Методы криосохранения можно также успешно применять в исследованиях по генной инженерии растений.

Для целей защиты растений от вредителей представляют интерес также культуры клеток насекомых

Для получения первичных культур клеток насекомых используют обычно гемоциты, яичники куколок или отрождающихся гусениц.

Начинают с того, что собирают в природе куколок, проводят поверхностную стерилизацию, затем асептически извлекают из них яичники и готовят взвесь клеток обработкой трипсином. Клетки культивируют сначала в каплях на покровных стеклах. После инкубирования при 28° через 24-28 ч клетки прикрепляются к стеклу и далее располагаются сплошным слоем. После пересадки на свежую среду получают перевиваемые, переживающие культуры. Обычно культивируют в так называемых матрасиках. Для клеток насекомых используют также суспензионные (роллерные) культуры. Самое главное назначение культур клеток насекомых - накопление в них бакуловирусов - основы энтомопатогенных препаратов для защиты растений.

В нашей стране эти работы появились в 60-е годы ХХ в. в лаборатории С. М. Гершензона. В настоящее время применяют линии клеток непарного шелкопряда, капустной и хлопковой совок и др.

Таким образом, клеточная инженерия является одним из основополагающих направлений современной биотехнологии. Предметом ее изучения служит культивирование растительных и животных тканей, органов и клеток с целью дальнейшей генетической трансформации. В основе клеточной инженерии лежит явление тотипотентности.