Биотехнология в защите растений - 3.1.2. Биопрепараты для подавления фитопатогенов

Биологические препараты против болезней производят на основе:

♦ микроорганизмов - антагонистов возбудителей болезней;

♦ микроорганизмов - гиперпаразитов фитопатогенов;

♦ антибиотиков, подавляющих возбудителей заболеваний.

Широко известен гриб-антагонист триходерма. Препарат триходермин готовят на основе грибов Trichoderma viride (=lignorum) (Fr.) Pers., T. harzianum Rif.

Эти грибы паразитируют на склероциях гриба Sclerotinia sclerotiorum, псевдосклероциях гриба Rhizoctonia solani, активны в отношении грибов р. Alternaria, Botrytis, Fusarium, Helmintosporium и др.

Триходерма образует хорошо развитую грибницу вначале белого, затем зеленого цвета. Размножается спорами (конидиями), которые образуются на конидиеносцах.

Самым распространенным продуцентом триходермина является T. viride. Это типичный почвенный обитатель, хорошо растёт на питательных средах. Чистые культуры гриба хранят в пробирках на сусло-агаре, картофельном агаре или плотной среде Чапека в холодильнике при 2-4°С. Через месяц хранения культуры пересевают на свежую среду, выращивают в термостате при 24-28°С в течение 3-4 дней и переносят в холодильник.

Один из важнейших факторов получения эффективного препарата - подбор перспективных высокоактивных штаммов. Источником выделения штаммов служит почва. При скрининге и апробации основное внимание уделяется способности штаммов синтезировать комплекс антибиотиков и ферментов. Триходермин получают поверхностным, глубинным и глубино-поверхностным методами на жидких, агаризованных и сыпучих питательных средах.

Наиболее распространен поверхностный способ. Процесс производства состоит из следующих операций:

1) приготовление посевного материала и питательной среды;

2) выращивание гриба на питательной среде или ферментация на сыпучих средах;

Для массовой наработки биопрепарата поверхностным способом в разных странах используют зерно, отруби, солому пшеницы, свекловичный жом, торф, шелуху подсолнечника. При подборе оптимальных сред для производства триходермина возникает необходимость введения в вышеперечисленные субстраты дополнительных компонентов. Например, пропитка суслом отходов ячменя от трихограммного производства в 2-3 раза увеличивает выход биопрепарата. В НИИ биологии Иркутского университета рекомендована среда для культивирования T. viride, состоящая из смеси соломы с ячменной лузгой. Доказана возможность получения триходермина на целлюлозных гранулах – измельченной фильтровальной и упаковочной бумаге, пропитанной суслом из расчета 50 мл на 10 г массы. Благодаря волокнистой структуре гранулы после высушивания не подвергались деформации. Способность гриба T. harzianum образовывать споры на гранулах была в 2-3 раза выше, чем на зернах ячменя. При поверхностной наработке биопрепарата получают влажный триходермин, который до использования хранят при температуре 10-12°С не более двух недель, и сухой с влажностью не более 10% и сроком хранения 1-1,5 года. Выращивая гриб на жидких питательных средах, получают на поверхности спорово-мицелиальную пленку. Её высушивают и перемалывают в порошок. В такой форме препарата отсутствует питательная среда, и цвет её зелёный с оттенками. Споровый препарат на основе T. harzianum получают глубинным способом, разработанным учеными Красноярского государственного университета.

Технология глубинного культивирования триходермина включает следующие этапы:

1) выращивание посевного материала в колбах на качалке 24 ч при 200 об/мин;

2) размножение посевного материала в посевном ферментере;

3) выращивание мицелиальной культуры в ферментере с мешалкой при 28°С и аэрации в течение 14 ч.

Пока недостатком глубинного культивирования является слабое созревание спор. Поэтому данным способом получают главным образом мицелиальную форму и хламидоспоры. В случае образования конидий в глубинной культуре они в большей степени подвержены повреждению внешнего покрова при обезвоживании препарата и снижению жизнеспособности, чем конидии, полученные в поверхностной культуре. Для исключения процесса обезвоживания биопрепарата, полученного в ферментерах, предпринята попытка применять его в виде гранул. Для этого влажную массу триходермы смешивают с автоклавированными смесями альгината натрия (20 г на 750 мл) и размолотыми пшеничными отрубями (50 г на 250 мл). Смесь добавляют по каплям в желеобразный раствор хлористого кальция для образования сферических гранул, которые высушивают на воздухе.

Можно использовать глубинно-поверхностный метод. Тогда полученную в ферментере биомассу объединяют со слоем субстрата (соломы, торфа), где и образуются конидии (через 9-10 сут при 28°С). После высушивания титр препарата составляет 10 млрд спор/г.

В настоящее время в защите растений все больше используют препараты, продуцентами которых служат антагонистические бактерии рода Pseudomonas: P. fluorescens Mig., P. auerofaciens Kluyver и др. Бактерии продуцируют антибиотики и сидерофоры, ростовые вещества (Смирнов, Киприанова, 1991). В этой серии первым был предложен препарат планриз (ранее - ризоплан), действующее начало которого выделено из зоны ризопланы пшеницы (100 мкм около корня). Автор препарата белорусский ученый А.Н. Перебитюк. В дальнейшем предложены РИЦ, агат-25, гаупсин, псевдобактерин, отличающиеся либо штаммом, либо препаративной формой. Это препараты на основе живых клеток, так как псевдомонады не образуют спор. Получение этих препаратов осуществляют глубинным способом.

Ряд препаратов против болезней растений созданы на основе бактерии – антагониста Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn. (сенной палочки). Первый препарат этой серии – бактофит применяют против гнилей, мучнистой росы и других болезней.

Препараты на основе бактерий-антагонистов хорошо

культивируются в ферментерах в заводских условиях

Примером препарата, действующим началом которого является гиперпаразит, служит ампеломицин. Грибы рода Ampelomyces паразитируют на мицелии и конидиях мучнисторосяных грибов. Заражение структур хозяина происходит путем прорастания конидий и образования ростковых трубок, которые разрушают клеточную оболочку и проникают внутрь её. В результате пораженная клетка возбудителя мучнистой росы вздувается. Через 3-5 дней в клетке закладываются пикниды, которые постепенно темнеют. Пораженный мицелий от этого становится не белым, а сероватым. На поверхности мицелия также закладываются пикниды, в которых формируется большое количество спор.

Культивирование Ampelomyces quisqualis Ces. в условиях биолабораторий начинается с выращивания посевной культуры активного штамма гиперпаразита. Выращивание посевной культуры проводится, например, на картофельно-глюкозной среде. Для приготовления 1 л картофельно-глюкозной cреды берут 300 г очищенного картофеля на 1 л воды и кипятят 30 мин. Отвар сливают, добавляют в него 20 г глюкозы и воды до 1 л, подкисляют до рН 5-6, вносят 20 г расплавленного агара и разливают по небольшим емкостям на 2/3 (например, бутылки). Стерилизуют при 1 атм 30-40 мин. Для получения посевной культуры в пробирку с маточной культурой активного штамма возрастом 2-3 недели вливают стерильную воду до получения титра 105 спор в 1 мл. Эту суспензию засевают в бутылки. Для получения биомассы гриба засыпают по 100 г отходов ячменя трихограммного производства, заливают водой, стерилизуют в автоклаве. Затем в боксе производят индивидуальный засев каждой емкости посевной культурой гриба. Засеянные бутылки ставят в термостаты при 22-24°С для выращивания гиперпаразита. Обычно через 3-4 недели биомассу высушивают. Полученный препарат хранят в сухом прохладном месте не более 6 месяцев.

Другим представителем препарата на основе гиперпаразита является пентафаг. Это вирусный препарат на основе пяти фагов бактерии Pseudomonas syringae van Hall., выделенных из почвы и больных растений. Препарат подавляет бактериальный рак плодовых, дырчатую пятнистость косточковых и угловатую пятнистость огурцов.

Поскольку вирусы являются облигатными паразитами, способными размножаться только в клетках хозяина, для производства препарата пентафаг необходимо:

♦ наработать биомассу бактерий, являющихся хозяевами бактериофагов;

♦ выделить размножившиеся вирусные частицы из биомассы.

Против возбудителей болезней растений применяют препараты на основе антибиотиков. Они не только подавляют развитие возбудителей, но также способны к нейтрализации токсинов и ферментов, выделяемых ими. Являясь биологически активными веществами, антибиотики оказывают сильное влияние на растения, повышая устойчивость к заболеваниям, стимулируя рост растений и способствуя повышению урожая.

Биологическую активность антибиотиков обычно выражают в условных единицах, содержащихся в 1 мл раствора (ед/мл) или 1 мг препарата (ед/мг).

Из отечественных антибиотиков для защиты растений наиболее распространен фитобактериомицин (ФБМ). Этот антибиотик, продуцируемый штаммом 696 Streptomyces lavendulae Waksman et Curtis, относится к стрептотрициновому ряду.

На основе ФБМ в настоящее время производится биопрепарат фитолавин-300 с активностью 300 тыс. ед. активности в 1 г.

В различные годы применялись, но не вошли в современный “Список…” трихотецин, фунгистоп и некоторые другие антибиотики.

Технология получения антибиотиков состоит из следующих этапов:

1) выращивание культуры микроорганизма-продуцента в посевных аппаратах;