3.1.5. Бактериальные удобрения

Некоторые бактерии (азоспириллы, клубеньковые бактерии и др.) способны в ассоциации с корнями растений фиксировать атмосферный азот. К этой группе микроорганизмов проявляется большой интерес, так как они перспективны для создания бактериальных удобрений.

Интродукция в почву селекционных рас азотфиксирующих бактерий (нитрагенизация) обеспечивает формирование активного симбио­тического аппарата и существенно повышает урожай сельскохозяйственных культур. В последнее время для повышения эффективности бобово-ризобиального комплекса используют популяции, состоящие из ризобий - клубеньковых бактерий, живущих в симбиозе с бобовыми растениями, и ассоциативных азотфиксаторов - бактерий, обитающих в ризоплане небобовых растений.

Разработаны препараты: нитрагин, ризоторфин, ризоэнтерин, ризоагрин, флавобактерин, агрофил. Ризоторфин применяют для обработки семян бобовых. При внесении под сою ризоторфин ограничивает также пораженность пероноспорозом. Ризоэнтерин и ризоагрин применяют для обработки семян зерновых культур и кормовых трав. Агрофил используют при возделывании овощных культур в открытом и защищенном грунте. Этот биопрепарат представляет собой торфяной субстрат, обогащенный углеводами и витаминами, на котором выращены бактерии-стимуляторы Agrobacterium radiobacter. В 1 г препарата содержится 109 клеток бактерий. Агрофил сравним с ТМТД по действию против бактериозов растений.

Остановимся на биотехнологии культивирования азотофиксирующих бактерий и получения биопрепаратов на их основе.

Первоначально пытались собирать клубеньки с корней, подсушивали, измельчали и такой материал использовали для обработки семян перед посевом. Ясно, что в таком инокуляте содержались различные по азотфиксирующей способности бактерии, не считая посторонней микрофлоры. Естественно, это побудило к работе по получению штам­мов, способных в максимальной степени фиксировать азот, и по изготов­лению препаратов на их основе.

Впервые препарат, содержащий культуры клубеньковых бактерий, для 19 видов бобовых изготовили в 1896 г. германские ученые и назвали его нитрагин. В ряде стран это название сохранилось до сих пор. В России в начале XX в. в этом плане были проведены серьёзные исследования, в результате которых в 20-30-х годах началось производство препаратов с использованием почвы как субстрата-носителя.

Технологический процесс изготовления препаратов клубеньковых бактерий включает:

1) хранение культур клубеньковых бактерий;

2) выбор формы препарата (сухой, жидкой);

3) получение жидкой культуры (инокулюм);

4) выбор вида субстрата-носителя и его подготовка;

5) инокуляция субстрата и культивирование;

5) хранение препарата;

6) контроль технологического процесса и качества конечного продукта.

Рассмотрим особенности некоторых этапов процесса.

Наиболее удобной считается сухая форма инокулята. Здесь также может помочь лиофилизация. Но тогда требуется постепенное приспособление культур: выдерживание при низких температурах определенный период, введение ингибиторов активного метаболизма. Зачастую такая транквилизация не используется, что приводит к неэффективности лиофилизации. В настоящее время доминирующей сухой формой инокулятов служит торфяная. Главным недостатком торфа является нестандартность. Предпочтительнее использовать «кислые» торфы с рН 3,0-5,0.

Для инокуляции торфа готовится жидкая культура клубеньковых бактерий в колбах, бутылях или ферментерах. Бактерии являются аэробами, поэтому жидкая культура перемешивается и аэрируется. В среднем подача воздуха должна составлять около одного объема на объем жидкой среды в минуту (л/л/мин). Чем концентрированнее питательная среда, тем в большей степени она должна аэрироваться. При выращивании клубеньковых бактерий существенная роль принадлежит величине рН. Оптимальное значение лежит в интервале 6,5-7,0.

Инокуляция торфа культурами клубеньковых бактерий можно проводить разными способами:

♦ жидкой культурой;

♦ смешиванием «старого» торфяного препарата со стерильным торфом.

Опыт ВНИИСХМ показал, что второй способ дает лучшие результаты по скорости наращивания титра бактерий и выживания при хранении препарата. Однако способ по схеме «торф–торф» требует большого количества старого препарата (не менее 10%). Поэтому чаще используется внесение жидкой культуры в торф. Успешному росту клубеньковых бактерий в торфе способствует добавление питательных веществ, прежде всего углеводов (меласса сахарной свеклы, декстрин, глицерин).

Готовые препараты рекомендовано хранить при относительно низких температурах (6-15°С).

Малотоннажная технология позволяет территориально приблизить изготовление препарата к месту его использования, а инокулят сделать максимально эффективным для конкретных сортов, точно отвечающим местным почвенно-климатическим условиям.

В соответствии с изложенными принципами рассмотрим приготов­ление препарата клубеньковых бактерий на примере ризоторфина.

В зависимости от скорости роста на плотных питательных средах различают быстро и медленно растущие ризобии. Для хранения в пробирках используют достаточно простые среды.

Например, для быстрорастущих бактерий состав среды (г/л) следующий: отвар гороха - 10, сахароза - 20, агар - 20, рН 6,8-7,0. Стерилизацию проводят 30 мин при 1 атм. Для приготовления горохового отвара 100 г гороха заливают 1 л водопроводной воды, доводят до кипения, кипятят 30 мин, фильтруют через марлевый фильтр и водой доводят объем до 1 л.

Получение маточных культур. Как правило, в колбы ёмкостью 750 мл наливают по 200 мл среды и каждую колбу засевают смывом с одной пробирки.

Получение рабочих культур. В зависимости от объема производства их выращивают либо в колбах 750 мл, содержащих 300 мл среды, либо в бутылях 5-2 л, либо в ферментерах (коэффициент заполнения 0,6). Любую ёмкость со средой засевают посевной (маточной) культурой клубеньковых бактерий в количестве 3-5% к объему рабочей среды. Затем помещают на качалку и выращивают при 28-30°С в течение 36-48 ч (соответственно быстро и медленно растущие). Содержание бактерий в конце выращивания должно составлять 5-8×109 клеток в 1 мл культуральной жидкости. Эту жидкость используют для инокуляции пакетов со стерильным торфом.

Подготовка торфа. Торф высушивают до воздушно-сухого состояния (20-25% влаги) и размалывают на мельницах с одновременным просеиванием так, чтобы размеры частиц не превышали 0,1 мм. Размолотый торф помещают в смеситель и прибавляют около 5% СаСО3, чтобы рН стало 6,8-7,0. Мел можно заменить доломитовой мукой. Одновременно добавляют воды, чтобы увеличить влажность торфа до 35-40%. Такой торф раскладывают в пакеты из полиэтиленовой пленки (25-32 см).  В каждый пакет помещают по 320 г торфа (порция на 1 га). Единственным рациональным способом стерилизации торфа является радиационный. Облучают жесткими гамма-лучами до 3 месяцев.

Инокуляция торфа. Стерильный торф в пакетах инокулируют охлажденной до 5-8°С смесью культуральной жидкости и раствора углеводов. Объем инокулюма 40-80 мл на каждый пакет. Эту смесь вводят острой полой иглой (диаметр около 0,5 см), прокалывая полиэтиленовую пленку. Затем отверстие заклеивают липкой лентой. Инокулированные пакеты загружают на 2-3 мин во вращающиеся смесители для перемешивания. В 1 г препарата исходный титр не ниже 0,5×109 клеток/г. За 3-7 дней выдерживания инокулированных пакетов при 18-20°С, титр бактерий вырастает не менее чем до 2,5-3×109 кл/г.

Все этапы технологического процесса производства ризоторфина находятся под тщательным микробиологическим контролем. Стерили­зованный торф и готовый препарат проверяют на присутствие посторонней микрофлоры. В готовом препарате допускается не более 1% посторонней микрофлоры. К концу шестимесячного хранения эта величина не должна превышать 10%.

Посевной материал на каждой стадии высевают на жидкие среды с мя­со­пептонной средой и выдерживают сут­ки. Клубеньковые бактерии не растут на такой среде, только конта­минанты.

По аналогичной технологии готовят препараты ассоциативных азотфиксирующих бактерий с учетом физиолого-технологических особенностей штаммов Azospirillum, Flavobacterium, Arthrobacter. Наиболее перспективными из ассоциированных с корнями небобовых растений считаются бактерии из рода Azospirillum, обитающие в ризосфере и ризоплане многих растений. Препараты на основе торфа готовят, например на основе A. lipoferum. В отличие от клубеньковых бактерий, здесь несколько изменен состав питательных сред.