в Приложения

Организация самостоятельной работы

Приложение  7

Общие принципы исследования живых структур при экологических исследованиях (выделение, концентрирование, элюирование ксенобиотиков из тканей)

Действие какого-либо соединения можно исследовать на некоторых клеточных структурах, каждую из которых необходимо для этого выделить из системы, т.е. гомогената, и подвергнуть анализу.

Часто исследуемое соединение представляет собой природный метаболит или входит в состав самого организма, а иногда является изотопом составного компонента организма. Полученные на различных уровнях результаты дают общее представление об этапах распада веществ и о конкретном участии каждой органеллы в этом процессе.

При исследовании живых структур все процессы изучаются на уровне клетки и клеточных структур. Результаты рассматриваются на уровне органов, тканей, всего организма и во взаимосвязи с окружающей средой.

Процессы, характерные для целой клетки, протекают в отдельных клеточных частицах и органеллах, которые для их анализа выделяют из клетки с помощью фракционирования. Клетки разрушают, а затем из суспензии методом центрифугирования выделяют нужные частицы и органеллы. Затем при исследовании веществ на атомном и молекулярном  уровнях применяют в том числе  ряд  спектральных и других методов.

Одним из условий сохранения работоспособности и функционирования субклеточных структур является сохранение рН среды, в которой они функционируют. Большинство внутриклеточных процессов протекает при нейтральных значениях рН, когда их скорость максимальна.

Гидролазы лизосом – структур, принимающих непосредственное участие в разложении ксенобиотиков, т.е. чужеродных веществ в организмах, обладают максимальной активностью при рН 5,0.

В биологических системах постоянная величина рН поддерживается с помощью эффективных буферных систем, которые по своей химической природе таковы, что они препятствуют изменениям рН, возникающим в ходе метаболического образования кислот (например, молочной кислоты) и оснований (например, аммиака). Большинство буферных систем, содержащихся в клеточных жидкостях, включают фосфаты, бикарбонаты,  аминокислоты и белки.

Величину буферного действия характеризуют буферной емкостью β. Буферная емкость равна количеству моль-эквивалентов сильного основания, или кислоты, которое необходимо добавить к 1 л буферного раствора для изменения его рН на одну единицу.

β=db/d(рН), где d(рН) – изменение рН раствора при добавлении db основания (его количества). Обычно пользуются буферными растворами из смеси слабой кислоты или основания и соли этой кислоты, например смеси уксусной кислоты и ацетата натрия. При добавлении к раствору слабой кислоты и ее соли ионы водорода нейтрализуются анионами соли, которые действуют в данном случае как слабое основание.

Гидроксильные ионы, наоборот, нейтрализуются кислотой. Отсюда следует, что буферная емкость раствора, составленного из данной кислоты и сопряженного с ней основания, максимальна в том случае, когда их концентрации равны, т.е.

рН = рКа (кислоты),

где Ка – константа ионизации кислоты.

Буферная емкость зависит также от общей концентрации раствора и отношения «соль – кислота»: чем выше концентрация раствора, тем больше его буферная емкость.

Концентрация кислоты и соли в буферных растворах обычно бывает порядка 0,05-0,2М, а достаточной буферной емкостью обладают растворы в области значения рН, равного рКа ± 1.

Буферы должны:

– обладать достаточной буферной емкостью;

– иметь высокую степень чистоты;

– хорошо растворяться в воде и не проникать через биологические мембраны;

– обладать устойчивостью к действию ферментов и гидролизу;

– рН буферных растворов должен как можно меньше зависеть от их концентрации, температуры и ионного или солевого состава среды;

– не оказывать токсического или ингибирующего действия;

– комплексы буфера с катионами должны быть растворимыми;

– не поглощать свет в видимой или ультрафиолетовой областях спектра.

Буферы для исследований лежат в области рН 6,0-8,0. Например, буферы с рН от 2,2 до 8,0 готовят из лимонной кислоты и двузамещенного фосфорно-кислого натрия.