Организация самостоятельной работы
Приложение 4
Центрифугирование
Принцип метода. Разделение веществ с помощью центрифугирования основано на разном поведении частиц в центробежном поле. Суспензию частиц, помещенную в пробирку, загружают в ротор, установленный на валу привода центрифуги. В центробежном поле частицы, имеющие разную плотность, форму или размеры, осаждаются с разной скоростью.
Скорость седиментации зависит от центробежного ускорения (G), прямо пропорционального угловой скорости ротора (ω, радс–1) и расстоянию между частицей и осью вращения (r, см):
G = ω2 r.
Поскольку один оборот ротора составляет 2π радиан, угловую скорость ротора в оборотах в минуту (обмин–1) можно записать так
а центробежное ускорение тогда будет равно:
Центробежное ускорение обычно выражается в единицах g (гравитационная постоянная, равная 980 см·с–1) и называется относительное центробежное ускорение (ОЦУ), т.е.
или
ОЦУ = 1,11 10–5 (обмин–1)2r.
При перечислении условий разделения частиц указывают скорость вращения и радиус ротора (r), а также время центрифугирования. Центробежное ускорение обычно выражают в единицах g, рассчитанных из среднего радиуса вращения (r средн.) столбика жидкости в центрифужной пробирке (т.е. расстояния от оси вращения до середины столбика жидкости). На основании уравнения составляют номограмму зависимости относительного центробежного ускорения от скорости вращения ротора и радиуса r. Для определения относительного центробежного ускорения соединяют прямой линией значения радиуса и скорости вращения ротора на крайних шкалах. Точка пересечения этой прямой со средней шкалой – искомая величина центробежного ускорения. Правая колонка цифр шкалы соответствует правой колонке цифр шкалы скорости вращения ротора, левая — левой.
Скорость седиментации сферических частиц зависит от центробежного ускорения, плотности и радиуса частиц, вязкости среды суспендирования. Время осаждения сферической частицы в жидкой среде от мениска жидкости до дна центрифужной пробирки обратно пропорционально скорости седиментации и определяется следующим уравнением:
где t – время седиментации, с;
η – вязкость среды;
rч – радиус частицы;
Рч – плотность частицы;
р – плотность среды;
Rм – расстояние от оси вращения до мениска жидкости;
Rд – расстояние от оси вращения до дна пробирки.
При заданной скорости вращения ротора время для осаждения гомогенных сферических частиц обратно пропорционально квадрату их радиусов и разности плотностей частиц и среды и прямо пропорционально вязкости среды. Смесь гетерогенных сферических частиц, различных по плотности и размерам, разделяют за счет разного времени осаждения их на дно пробирки при данном ускорении. Компоненты клетки осаждаются в следующей последовательности: 1) клетки целые и их фрагменты; 2) ядра; 3) хлоропласты; 4) митохондрии; 5) лизосомы (или другие микротельца); 6) микросомы (фрагменты гладкой и шероховатой эндоплазматической сети); 7) рибосомы.