Тема 6

Работа 6.8

Подготовка веществ к анализу - озоление растительного вещества.

Определение азота и зольных элементов

При определении азота и зольных элементов в расте­ниях используют как свежий, так и сухой матери­ал. Озоление осуществляют двумя способами:

- сухим способом при высокой температуре, при этом азот не определяют;

- мокрым способом, в основном концентрированными кислотами:

H2SO4 + катализаторы; H2SO4 + HNO3; HNO3 + HNO2; H2SO4 + KC1O3; K2SO4 + HC1O4; H2SO4 + KMnO4; H2SO4 + H2O2 и др.

Сухим озолением в золе определяют фосфор, калий, кальций, магний, железо, алюминий, кремний, марганец и некоторые тяжелые металлы.

При определении в золе фосфора, калия и натрия озоление проводят с большой осторожностью, не допуская высокой темпе­ратуры в муфельной печи. При температуре свыше 500°С фосфор­ная кислота с углем может восстанавливаться до свободного фос­фора, а калий и натрий в форме хлоридов - улетучиваться.

Преимущество сухого озоления состоит в том, что не требуется использование концентрированных кислот и солей.

Навеску измельченного на мельнице материала (в среднем 3-5 г) неплотно укладывают в просушенный и взвешенный тигель и на­крывают крышкой. На первой стадии сжигание в вытяжном шка­фу проводят при температуре примерно 180°С, а после прекраще­ния выделения продуктов перегонки, по истечении 30 мин, при­открыв крышку, тигель ставят в муфельную печь до полного озо­ления. Оптимальной температурой считается 400-500°С. Иногда при длительном прокаливании зола сохраняет темный цвет. Это происходит потому, что соли золы обволакивают частицы угля и задерживают сжигание. В таком случае после охлаждения тигля к золе приливают 10-15 капель воды или 5-6 капель 30%-го пероксида водорода. При слабом подогревании выпаривают жид­кость и продолжают сжигание до получения светлой золы. После озоления тигель прикрывают крышкой, охлаждают в эксикаторе и взвешивают. Содержание золы в процентах рассчитывают по формуле:

где а - масса золы, г;

100 - коэффициент для выражения результатов в процентах;

б - навеска сухого вещества, г.

Для ускорения озоления и предотвращения потерь фосфора к анализируемой навеске рекомендуют прибавлять в небольших ко­личествах ацетат кальция, оксид кальция, оксид магния, ацетат магния и др. В результате сухого озоления получают так называе­мую «сырую» золу, потому что в ней оста­ется небольшое количество углистых частиц. При сухом озолении органического вещества кальций, магний, калий, натрий образуют карбонаты, а фосфор - однозамещенный фосфат кальция.

Для ускорения озоления Н. Проскуряков, С. Темерин в 30-е годы XX в. предложили к навеске 1-1,5 г приливать 1,5 мл спиртоглицериновой смеси. Озоление заканчивается примерно через 2 ч после помещения тигля в муфель. Ускорить озоление можно до­бавлением по 5-6 капель пероксида водорода, однако при этом возможны незначительные потери фосфора и калия. Полученную сырую золу растворяют в 20 мл 10%-й соляной кислоты, раствор фильтруют, выпаривают досуха и осадок снова растворяют в соля­ной кислоте и фильтруют. Так повторяют четыре раза. Выделившу­юся кремнекислоту отфильтровывают, фильтр промывают горячей водой, подкисленной несколькими каплями крепкой соляной кис­лоты, фильтрат доводят в мерной колбе на 200-250 мл дистиллиро­ванной водой до метки и перемешивают. Из мерной колбы берут определенные объемы раствора для определения вышеуказанных элементов.

Озоление растений мокрым способом. Мокрое озоление более универсально, так как улетучивание фосфорной кислоты и других элементов почти исключено.

Наиболее старыми являются методы Меркера и Неймана. Сначала Меркер предложил вести озоление концентрированной H2SO4 с добавлением по каплям HNO3, Нейман - смесью H2SО4 и HNO3, взятых в равных объемах. Однако и в том и другом случае происходили потери фосфора.

В начале XX в. в Пе­тербургской сельскохозяйственной химической лаборатории и лаборатории Всероссийского общества сахарозаводчиков также ис­пользовали H2SO4 и HNO3 в разных соотношениях.

А.Н. Лебедянцев сравнил все методы, выявил условия потери фосфора в процессе озо­ления и предложил свой метод. В полученной золе можно опре­делить Р, К, Са, Mg, Na, Fe, Mn, Al. A.H. Лебедянцев предложил навеску обрабатывать 68%-й азотной кислотой с удельной массой 1,41. На 2-3 г вещества ее берут 10-15 мл, после выпаривания добавляют еще 2-4 мл. После осветления прибавля­ют на 1 г вещества 1 мл концентрированной серной кислоты с удельной массой 1,84. По мере испарения азотную кислоту добав­ляют по 1-1,5 мл. Азотная и серная кислоты являются сильными окислителями. При высокой температуре они распадаются:

2HNO3 → Н2О + 2NO2;              2H2SO4 →  2Н2О + 2SO2 + О2

Выделившийся кислород окисляет углерод до СО2, водород - до Н2О, а сульфгидрильную группу (SH) - до сульфата (SO4).

После окончания озоления колбу охлаждают и приливают до половины дистиллированной воды. Иногда раствор приобретает зеленоватую окраску, это значит, что сжигание не закончено или в растворе имеются оксиды азота. После 20-30 - минутного кипя­чения содержимое в колбе должно быть бесцветным. Если раствор остается желтым или зеленым, его выпаривают, добавляют 3-5 ка­пель азотной кислоты и продолжают озоление.

После полного озоления и охлаждения приливают воду и фильтруют в мерную колбу на 250-500 мл, добавляют до метки воды, перемешивают. Такого объема достаточно, чтобы определить все зольные элементы.

Мокрое озоление по Лебедянцеву позволяет определить только зольные элементы. Одним из основных его недостатков является длительность озоления. На сжигание навески тратится не менее 8-10 ч при температуре 330°С, а при более низкой температуре - до суток.

Отечественные ученые еще в 30-е годы XX в. предпринимали попытки разработать методики озоления, позволяющие опреде­лять одновременно азот и зольные элементы. Впервые В. Пиневич в этих целях предложил использовать концентрированную H2SO4 и 30%-й Н2О2. По его методике навеску растительного матери­ала 0,5-1,0 г в колбе Кьельдаля заливают 5-10 мл H2SО4 и 1-2 мл Н2О2. Озоление проводят на электрических плитках в тече­ние 2 ч. Оно считается законченным, если жидкость в колбе не темнеет и при добавлении 1-2 капель Н2О2 при подогреве интенсивно выделя­ются белые пары. Метод Пиневича совершенствовали А.М. Мещеряков, Н.М. Майборода, В.Т. Куркаев и др.

Предложенные модификации отличаются друг от друга незна­чительно, в основном последовательностью приливания Н2О2 и посудой для озоления. А.М. Мещеряков предлагал навеску 0,1 г в пробирке заливать 2 мл H2SO4 и после подогревания добавлять по 5-6 капель Н2О2. Н.М. Майборода предлагает одновременно на­веску обрабатывать 2 мл H2SO4 и 2 мл Н2О2. Модификации относятся к микрометодам, так как берется небольшая аналити­ческая навеска и малообъемная посуда.

Наиболее точные результаты при ускоренном озолении полу­чают при озолении растительного материала по К.Е. Гинзбургу.

Гинзбург предложил для сжигания использовать концентрирован­ную серную кислоту удельной массой 1,84 и 60%-ю хлорную кислоту (5 мл H2SO4 + 0,4 мл НСlО4) для сжигания одной навески (0,1-0,2 г). После прибавления смеси кислот колбы оставляют на 30-60 мин, затем проводят слабое нагревание в течение 5-7 мин до образования однородной коричнево-бурой массы. После этого температуру повышают и озоление продолжают до полного обес­цвечивания, которое наступает примерно через 15-25 мин. Если озоление не произошло, то необходимо добавить еще 1-2 капли НСlО4 и продолжить его.

При определении общего и белкового азота широко использу­ют сжигание по Кьельдалю. Метод стандартизирован (ГОСТ 10846-64) и является наиболее надежным, так как потери азота при сжи­гании исключены. Этот метод был предложен в 1883 г. и считает­ся классическим.

По Кьельдалю навеску 0,5-2,0 г переносят в кьельдалевские колбы для озоления разного объема - от 50 до 750 мл и заливают в зависимости от массы навески 10-25 мл крепкой H2SO4 c удельной массой 1,84. Колбу нагревают до обуг­ливания навески. Так как озоление навески происходит медлен­но, для ускорения процесса применяют катализаторы: Гунина - металлическую ртуть или медь и K2SO4 для повышения темпера­туры кипения; Шедда - Nа2SO4; Клеемана - Н2О2; Шерера - селен в порошке и т.д. Основа осталась, она заключается в переводе всего азота навески в аммиак. При использовании катали­затора и температуры 300 °С сжигание заканчивается за 5-8 ч.

Химические реакции при сжигании сложны. Их можно пред­ставить лишь схематически. Серная кислота при нагревании в присутствии органических веществ распадается на оксид серы, воду и кислород:

2H2SО4 → 2SO2 + 2Н2О + О2

Кислород, обладающий высокой окислительной способнос­тью, окисляет углерод и водород органических веществ:

С + О2 = СО2;        2Н2 + О2 = 2Н2О

Под влиянием серной кислоты белок распадается на аминокис­лоты, взаимодействие их можно представить следующим образом:

NH2 • СН2 - СООН + 3H2SO4 = NH3 + 2СО2 + 3SO2 + 4Н2О

Получившиеся при этом диоксид углерода, оксид серы и вода улетучиваются, а аммиак связывается серной кислотой, которую для озоления берут в небольшом избытке:

2NH3 + H2SO4 = (NH4)2SO4

Безазотистые органические вещества также разрушаются с образованием диоксида углерода и воды, например:

С6Н12О6 + 12H2SO4 = 6СО2 + 18Н2О + 12SO2

Освобождающаяся сера при распаде белка окисляется:

S + 2H2SO4 = 3SO2 + 2Н2О.

Как отмечалось, для повышения температуры кипения серной кислоты и ускорения сжигания (окисления) применяют катализаторы. Катализаторы легко окисляются серной кислотой с выделением активного кислорода, который ускоряет процесс окисления. Химизм показан на примере селена:

2H2SO4 + Se = 2SO2 + H2SeO3 + H2O.

Образовавшаяся селенистая кислота распадается на диоксид селена и воду:

H2SeO3 → SeO2 + Н2О.

Диоксид селена отдает кислород на окисление восстановлен­ных веществ в растении, а освободившийся металлический селен снова взаимодействует с серной кислотой, и процесс повторяется:

SeO2 → Se + О2.

На 1 мл серной кислоты достаточно 0,005 г селена, чтобы ускорить сжигание.

Затем содержимое колбы [(NH4)2SO4] переносят в отгоночную (перегонную) колбу, приливают 30-40%-й раствор щелочи (NaOH или КОН) и проводят отгонку в титрированный раствор серной или борной кислот:

(NH4)2SO4 + NaOH = Na2SO4 + 2NH4OH;

2NH4OH → 2NH3 + 2H2O (в отгоночной колбе);

2NH3 + H2SO4 = (NH4)2SO4 (в приемной колбе).

Если в качестве катализатора используют ртуть, то в процессе озоления образуются ртутно-амидные соединения, которые разру­шаются водородом; последний образуется в присутствии цинка. Поэтому при приливании щелочи одновременно в отгоночную колбу кладут кусочек цинка. Между цинком и ртутно-амидными соединениями протекает реакция:

Zn + 2NaOH = Zn(ONa)2 + Н2;

(NH2Hg)2SO4 + Н2 = (NH4)2SO4 + 2Hg.

Окончание отгонки устанавливают реактивом Несслера. Для этого из-под носика холодильной трубки набирают около 2 мл ра­створа и приливают 1 каплю реактива, который дает с аммиаком желтоокрашенное соединение (йодистый меркураммоний). Если такой окраски нет, отгонку следует считать законченной.

Количе­ство оставшейся кислоты (не связанной аммиаком) титруют щело­чью такой же концентрации в присутствии индикатора метилоран­жа до слабо-розовой окраски.

Азот рассчитывают по формуле:

где а - мл 0,1 н. H2SО4 в приемной колбе;

К1 - поправка к титру кислоты;

б - мл 0,1 н. NaOH или КОН, пошедшей на титрование кислоты в приемной колбе;

K2 - поправка к титру щелочи;

0,0014 г азота соответствует 1 мл 0,1 н. H2SО4, при использовании 0,2 н. H2SO4 - 0,028 г и т. д.;

100 - коэффициент для выражения результатов в процентах;

н - навеска, г.

Чтобы получить содержание сырого протеина, процент азота умножают на коэффициент 6,25.

Если растительный материал содержит значительное количе­ство нитратов, озоление проводят не серной кислотой, а фенолсерной, так как она при озолении восстанавливает нитраты и нит­риты до аммиака. Фенолсерная кислота представляет смесь 40 г фенола (СбН5ОН) в 1 л концентрированной серной кислоты удельной массой 1,84. Метод носит название Кьельдаля-Иодльбауэра. Реакции при сжигании остаются такими же, как и в методике Кьельдаля, восстановление нитратов происходит следу­ющим образом:

C6H4(HSO3)OH + HNO3 = C6H4(NO2)OH + H2SO4,

Фенолсерная кислота            Нитрофенол

т. е. нитратный азот переходит в органическую форму.

Нитрофенольный азот восстанавливается до аммиака водородом, который образуется во время озоления при прибавлении цинка:

Zn + H2SO4 = ZnSO4 + Н2;

C6H4(NО2)OH + ЗН2 = C6H4(NH2)OH + 2Н2О.

Нитрофенол                       Аминофенол

При дальнейшем сжигании аминофенол разрушается серной кислотой с образованием аммиака и связывается до сульфата аммония. Аммиак органических соединений и образовавшийся после восстановления нитратов связывается в сульфат аммония, аммиак которого отгоняется в аппарате Кьельдаля. При ускоренном озолении небольших навесок конечным азот­ным соединением является также сульфат аммония.

Общее содер­жание азота определяют колориметрически, в качестве красителя используется реактив Несслера. Для окрашивания из мерной колбы берут от 2 до 10 мл раство­ра, столько же 2,5%-й щелочи для нейтрализации кислой среды и 2 мл реактива Несслера. Образуется иодид оксидимеркурат ам­мония желтого цвета, интенсивность окраски зависит от количе­ства аммиака в растворе.

(HgI • 2KI)2 + ЗКОН + NH3 = Hg2NH2IO + 7KI + 2Н2О.

Реактив Несслера        Иодид оксиди-меркурат аммония

Аммонийный азот может быть определен колориметрически в виде окрашенного индофенольного соединения, образующе­гося при взаимодействии аммиака с салицилово-кислым натри­ем (C7H6O3Na2  2Н2О) и гипохлоритом натрия (NaClO).

Гипохлорит натрия представляет смесь двух солей: СаСl2 + Na2CO3. Обра­зующаяся бирюзовая окраска индофенольной зелени сохраняется в течение 2,5 ч. Формула индофенольной зелени:

При определении белкового азота в растительном веществе белок вначале осаждают гидратом оксида меди и отмывают от небелковых азотистых соединений. Гидрат оксида меди образуется в самом растворе при прибавлении CuSO4 и NaOH. Щелочь приливают в таком количестве, чтобы реакция была нейтральной. Образуется основная серномедная соль CuSO4 Cu(OH)2. Навеску (1-2 г сухого материала или 5-7 г сырого) заливают 50 мл теплой дистиллированной воды и при помешивании прибавляют 25 мл раствора медного купороса, а затем 25 мл раствора едкого натра. Осадок белка выпадает быстро. Отфильтровав его и освободившись от небелкового азота путем отмывки водой, осадок белка с фильтром подсушивают при температуре не выше 50°С и вместе с фильтром сжигают по Кьельдалю.

Отогнав азот в аппарате Кьельдаля таким же способом, как и при определении общего азота, умножив содержание азота в процентах на коэффициент 5,7, получают содержание белка в процентах.

Контрольные вопросы

1. Назовите отличие сухого озоления от мокрого.

2. Можно ли определить азот после сухого озоления?

3. Какие кислоты в основном применяют при озолении мокрым способом?

4. Какие катализаторы в основном применяют при озолении мокрым способом?

5. Как рассчитать содержание золы в процентах после сухого озоления?