7.3. Рекомбинантные штаммы микроорганизмов как основа биопрепаратов
Для повышения эффективности биопрепаратов на основе энтомопатогенов, микробов-антагонистов и других биоагентов применяют методы генной инженерии. Для этого конструируют рекомбинантные (включающие ДНК разных источников) штаммы с заданными свойствами. Основная цель их создания - повысить биологическую активность и расширить спектр действия.
Большая часть работ выполнена с генами эндотоксина БТ. Как известно, разные cry-белки БТ проявляют разную активность и специфичность (Штерншис и др., 2003). Желательно создание комбинаций генов с синергическим эффектом. Прорыв в этой области произошел в 1989 г., когда несколько независимых групп зарубежных исследователей применили метод электропорации для трансформации вегетативных клеток БТ плазмидной чужеродной ДНК. Приведем примеры подобных исследований российских ученых. В ГНЦ прикладной микробиологии сконструированы два рекомбинантных штамма БТ: К-19 и LТ-1. Первый получен путем переноса плазмиды из БТ подвида kurstaki, детерминирующий синтез Сry 1Ab, в клетки акристаллического варианта БТ подвида thuringiensis 98. Второй - путем переноса этой же плазмиды в БТ подвида tenebrionis. Штамм К-19 отличался более высоким содержанием экзотоксина. Преимущество штамма LT-1 - в его способности к синтезу токсинов, специфичных и для чешуекрылых, и для жесткокрылых насекомых.
Разработана также технология производства инкапсулированных биоинсектицидов нового поколения на основе рекомбинантных штаммов псевдомонад - продуцентов кристаллического эндотоксина БТ. Так, ген Bt ssp. tenebrionis внедрен в штамм P. putida с помощью плазмиды. Полученный препарат превосходил БТБ (рекомендованный в России) по активности против колорадского жука.
Скрещивание различных штаммов БТ с последующим отбором рекомбинантных штаммов разработали в ГосНИИ генетики и селекции микроорганизмов. Генетический обмен осуществляли конъюгацией. Использовали БТ подвида тенебрионис, скрещивая его с подвидом курстаки. На основе рекомбинантного штамма получена опытная партия препарата куртен.
Реализована и другая возможность - объединения БТ и бакуловирусов на генетическом уровне. В геном ВЯП калифорнийской люцерновой совки (Autographa californica L.) внедрили гены БТ - cry 1Ab и cry 1Ac. Хотя рекомбинантный штамм не обладал более высокой инсектицидной активностью, его преимущество состояло в сокращении латентного периода.
В дополнение к методам молекулярной рекомбинации используют методы слияния протопластов. Так были получены, например, гибриды Bt ssp. galleriae и Bt ssp. israelensis. Лизис клеточной стенки происходил в питательной среде под действием лизоцима. После индуцированного полиэтиленгликолем слияния протопластов производили высев на полноценную среду, затем колонии методом отпечатков переносили на селективные питательные среды.
Отметим также возможность переноса генов БТ в другие микроорганизмы для увеличения персистентности в полевых условиях. Так, в фирме “Микоген” (Калифорния) внедрили ген БТ в бактерию Pseudomonas fluorescens. В результате эта бактерия начала в массе производить БТ-токсин. После гибели бактерии псевдомонас ее оболочка превратилась в биокапсулу, начиненную БТ-токсином. При обработке растений такими биокапсулами эффект защитного действия продлевается на несколько недель вместо обычных нескольких дней. Известен также опыт переноса БТ в азоспириллы или в клубеньковые бактерии, заселяющие корневую систему. Получены трансформированные штаммы клубеньковых бактерий, содержащие cry-гены БТ, способные к азотфиксации и к синтезу δ-эндотоксина.
На основе ризосферных бактерий родов Pseudomonas и Bacillus получены штаммы, активные как против фитофагов, так и против бактериальных и грибных фитопатогенов (Добрица, 2000).
Среди энтомопатогенных грибов впервые генноинженерный подход был применен к M. anisopliae. В первом генетически модифицированном энтомопатогенном грибе в геном M. anisopliae был введен ген, кодирующий протеазу, для деградации кутикулы насекомых (St Leger et. al., 1996). Это привело к значительному сокращению периода от заражения до гибели насекомых и не изменило круга хозяев.
Таким образом, генноинженерные подходы весьма перспективны для будущего развития такого направления науки и практики, как защита растений от вредных организмов. Квалифицированное использование методов генной инженерии при строгом соблюдении законов в этом виде деятельности обеспечит увеличение продукции растениеводства при высоком уровне экологической безопасности.
